Главная > Химия > Основы биохимии, Т.2.
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

16.8. Применение изотопных методов в изучении цикла лимонной кислоты

Впервые предположение о существовании цикла лимонной кислоты было высказано на основании экспериментов с суспензиями измельченной мышечной ткани. Подробно ход превращений был выяснен позже с помощью высокоочищенных препаратов отдельных ферментов цикла. Предстояло установить, действительно ли эти ферменты функционируют в интактных клетках и достаточна ли скорость обращения веществ в цикле лимонной кислоты, чтобы с его помощью можно было обосновать суммарную скорость окисления глюкозы в животных тканях. Для получения ответа на эти вопросы были предприняты исследования с мечеными метаболитами, такими, как пируват или ацетат, у которых определенные атомы углерода в молекуле были помечены изотопами или . С помощью изотопных методов во многих строгих экспериментах были получены убедительные доказательства как самого существования цикла лимонной кислоты в интактных клетках, так и его высокой активности.

Некоторые ранние эксперименты с применением изотопов дали, однако, неожиданные результаты, породившие серьезную полемику о путях и механизмах отдельных реакций цикла лимонной кислоты. Эти результаты свидетельствовали, казалось бы, о том, что лимонная кислота не является первой трикарбоновой кислотой, образующейся в цикле. Соответственно и цикл стали называть не циклом лимонной кислоты, а циклом трикарбоновых кислот (сокращенно ЦТК). Позднее, однако, было твердо установлено, что в качестве первого продукта конденсации образуется именно лимонная кислота. Подробности, касающиеся этого эпизода из истории открытия цикла лимонной кислоты, мы приводим в дополнении 16-1.

Дополнение 16-1. Действительно ли первой из трикарбоновых кислот образуется в цикле лимонная кислота?

Как только стали доступны стабильный изотоп углерода и радиоактивные изотопы этого элемента исследователи сразу же воспользовались ими для того, чтобы проследить путь атомов углерода в цикле лимонной кислоты. В одном из таких экспериментов, положившем начало дискуссии о роли лимонной кислоты, ацетат, меченный по углероду карбоксильной группы инкубировали в аэробных условиях с суспензией ткани. Поскольку ацетат в животных тканях превращается ферментативным путем в ацетил-СоА (разд. 18.2), такая постановка опыта давала возможность проследить путь карбоксильного углерода ацетильной группы ацетил-СоА в реакциях цикла. После инкубации из препарата ткани выделили -кетоглутаровую кислоту. Ее подвергли расщеплению в обычных химических реакциях, чтобы установить положение метки, первоначально находившейся в карбоксильной группе ацетата. В результате конденсации немеченого оксалоацетата с ацетатом, меченным по карбоксильной группе, должен был образоваться цитрат, меченный только по одной из двух своих первичных карбоксильных групп (рис. 1).

Поскольку молекула лимонной кислоты не обладает асимметрией, т. е. не содержит асимметрического углеродного атома, две ее концевые карбоксильные группы химически неразличимы. Следовательно, одна половина меченых молекул цитрата, образовавшихся из меченого ацетата, должна была, казалось, дать -кетоглутарат, несущий метку в -карбоксильной группе, а другая половина - -кетоглутарат с меткой в -карбоксильной группе; иными словами, должен был образоваться -кетоглутарат, несущий метку в обеих карбоксильных группах.

Рис. 1. Включение меченого атома углерода ацетильной группы в -кетоглутаровую кислоту в цикле лимонной кислоты. Молекула лимонной кислоты, образующейся в цитратсинтазной реакции, не содержит хирального центра (т. е. асимметрического атома углерода). Поэтому следовало ожидать, что из нее будут получаться два разных вида меченой -кетоглутаровой кислоты, как показано на рисунке.

В действительности же образуется лишь тот вид, к которому ведет путь 1, т. е. -кетоглутарат, меченный по -карбоксильной группе. Углеродные атомы ацетильной группы, включившейся в цикл, выделены красным.

Однако, вопреки ожиданию, оказалось, что выделенный из тканевой суспензии -кетоглутарат содержит метку только в одной -карбоксильной группе (рис. 1). На основании этого было сделано заключение, что ни сама лимонная кислота, ни какое-либо другое соединение с симметрическими молекулами не может быть промежуточным продуктом на пути от ацетата к -кетоглутарату. Было высказано предположение, что первым продуктом конденсации ацетата с оксалоацетатом является не лимонная, а какая-то асимметрическая трикарбоновая кислота, по-видимому цис-аконитовая или изолимонная. Из-за этого было изменено и название цикла его стали называть циклом трикарбоновых кислот.

Однако в 1948 г. А. Огстон, биохимик из Оксфордского университета, указал, что хотя молекула лимонной кислоты и не содержит асимметрического атома углерода, она тем не менее может вести себя как асимметрическое соединение, если атакующий ее фермент имеет асимметрический активный центр.

Огстон предположил, что в активном центре аконитазы (фермента, действующего на новообразованный цитрат) имеются три точки для связывания молекулы цитрата и что эта молекула присоединяется к активному центру фермента специфическим образом в трех этих точках сразу. Как видно из рис. 2, присоединение молекулы цитрата к трем точкам может реализоваться только одним единственным путем, и это объясняет нам, почему метка обнаруживается только в одной из двух карбоксильных групп а-кетоглутарата.

Рис. 2. Лимонная кислота относится к прожирал ьным соединениям. Это ее свойство проще всего объяснить, представив себе, что молекула лимонной кислоты присоединяется к активному центру фермента аконитазы специфическим образом в трех точках. Хотя в этой молекуле нет асимметрического атома углерода, три различных заместителя при ее центральном углеродном атоме могут присоединяться к комплементарным группам активного центра фермента только одним единственным способом. А. Структура лимонной кислоты. Б. Схематическое изображение молекулы лимонной кислоты: . В. Правильная комплементарная «подгонка» молекулы лимонной кислоты к связывающему участку (активному центру) аконитазы. Существует только один способ присоединения трех специфических групп лимонной кислоты к трем связывающим точкам активного центра аконитазы. Поэтому аконитаза может взаимодействовать только с одной из двух групп, а именно с группой Органические соединения, не имеющие в своей молекуле хирального центра, но потенциально способные взаимодействовать с асимметрическими активными центрами фермента как асимметрические соединения, называются прохиральными.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление