Пред.
След.
Макеты страниц
Распознанный текст, спецсимволы и формулы могут содержать ошибки, поэтому с корректным вариантом рекомендуем ознакомиться на отсканированных изображениях учебника выше Также, советуем воспользоваться поиском по сайту, мы уверены, что вы сможете найти больше информации по нужной Вам тематике ДЛЯ СТУДЕНТОВ И ШКОЛЬНИКОВ ЕСТЬ
ZADANIA.TO
ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИВ основе методологии генной инженерии лежит выделение ДНК и проведение различных манипуляций с ее молекулами, включая получение химер (например, молекулы ДНК, построенной из фрагментов ДНК человека и бактерий). Ферменты рестрикцииОдин из важнейших инструментов генной инженерии — эндонуклеазы, ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов внутри цепи (в противоположность экзонуклеазам, которые расщепляют ДНК с концов молекулы). Эти ферменты получили название рестриктаз, поскольку их присутствие в бактериальной клетке ограничивает рост определенных бактериальных вирусов, называемых бактериофагами. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках последовательности строго определенной структуры. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических
Рис. 36.1. Организация транскрипционной единицы и этапы экспрессии эукариотических генов. Эукариотические гены состоят из структурной и регуляторной областей. Структурная область представлена кодирующей ДНК и некодирующими 5- и З-последовательностями. Кодирующая ДНК включает экзоны — участки ДНК, транскрипты которых остаются в составе зрелой мРНК, и интроны (транскрипты этих последовательностей удаляются из РНК в ходе процессинга). Структурная область гена ограничена с 5-конца сайтом инициации транскрипции, а с З-конца—полиаденилатным сайтом или сайтом терминации. Промоторная область, содержащая специфические последовательности, взаимодействующие с белковыми факторами, рассмотрена в гл. 39 и 41. Первичный транскрипт имеет на 5-конце специфическую структуру—КЭП и участок, богатый «А» на З-конце. После удаления интронов из первичного транскрипта образовавшаяся зрелая мРНК транспортируется в цитоплазму, где и транслируется с образованием белковой молекулы. или физических воздействий, приводящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются частью защитной системы бактерий, охраняющей собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной, ДНК. Рестриктазы присутствуют только в таких клетках, которые содержат и специфические метилазы. Роль этих ферментовметилирование собственной (хозяйской) ДНК клетки и защита ее таким образом от действия рестриктаз. Сайт - специфические метилазы и рестриктазы всегда присутствуют в бактериях одновременно. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют (табл. 36.1). Так, название Таблица 36.1. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности (см. скан) образом, можно рассчитать частоту встречаемости участка узнавания для данной рестриктазы. В каждой нуклеотидной позиции молекулы ДНК с одинаковой вероятностью может оказаться один из 4-х нуклеотидов (A, G, С, Т). Поэтому фермент, узнающий четырехзвенную последовательность, будет находить одну мишень на 256 пар оснований (44). В то же время фермент, различающий шестизвенную последовательность, будет находить специфический участок узнавания 1 раз на 4096 пар оснований Таблица 36.1. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности
Рис. 36.2. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами (рестриктазами). В результате рестрикции образуются фрагменты (рестрикты) либо с «липкими» Любой фрагмент ДНК обладает характерным расположением сайтов узнавания различных рестриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участки. Такие фрагменты можно разделить методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле (о методах блоттинга см. ниже). Эта процедура, основанная на применении рестриктаз, представляет собой важнейший этап клонирования генов. Другие ферментыРяд других ферментов, использующих ДНК в качестве субстрата, также имеет важное значение для генной инженерии. На некоторых из них мы остановимся в этой и последующих главах (табл. 36.2). Конструирование химерных молекул ДНК Ковалентное соединение (в дальнейшем мы будем пользоваться термином «лигирование») липких концов фрагментов ДНК — процедура технически не Таблица 36.2. Ферменты, используемые в работе с рекомбинантными ДНК. (Adapted and reproduced, with permission, from Emery A.E. H. Page 41 in: An introduction to Recombinant DNA, Wiley, 1984.)
сложная, однако при этом могут возникать определенные проблемы. Так, липкие концы вектора могут лигироваться сами на себя без включения клонируемого фрагмента. Кроме того, может произойти отжиг липких концов двух различных фрагментов, что приведет к образованию гетерогенной вставки. Не все интересующие исследователя участки ДНК содержат удобно расположенные сайты узнавания для рестриктаз, дающих липкие концы. Для преодоления этих трудностей иногда используют рестриктазы, образующие тупые концы, после чего с помощью специфического фермента (терминальной трансферазы) генерируют новые концы. Так, присоединение к З-концам вектора гомополимерной цепочки, состоящей из dG, а к З-концам клонируемого фрагмента ДНК — цепочки КлонированиеПонятие «клон» определяе Бактериальные плазмиды — это небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, в функции которых входит, например, обеспечение устойчивости к антибиотикам для несущих их хозяйских клеток. Плазмиды обладают несколькими свойствами, которые делают их чрезвычайно удобными для использования в качестве векторов для клонирования: 1) в бактериальной клетке они могут существовать в одной или множестве копий; 2) реплицируются плазмиды независимо от хозяйской ДНК. В настоящее время для многих плазмид уже известна полная нуклеотидная последовательность. Это делает возможным точную локализацию сайтов рестрикции для клонирования фрагментов ДНК. Плазмиды значительно меньше хозяйской хромосомной ДНК и поэтому могут быть легко отделены от нее. Клонированный фрагмент легко выделяется из рекомбинантной плазмиды посредством ее расщепления той же рестриктазой, по сайту которой проводили лигирование. Фаги обычно содержат линейную ДНК, в которую могут быть встроены фрагменты чужеродной ДНК по какому-либо из доступных сайтов рестрикции. Химерную ДНК выделяют обычно после завершения рекомбинантным фагом литического цикла и выхода зрелых инфекционных фаговых частиц. Основным преимуществом фаговых векторов перед плазмидными является то, что в отличие от плазмид, способных нести фрагменты ДНК до 6—10 т. п. н., в фаговые частицы удается встраивать фрагменты размером до 10—20 т. п. н. Величина клонируемого фрагмента определяется общим количеством ДНК, способным упаковываться в головку фага. Фрагменты еще большего размера могут быть клонированы в космидах—векторах, объединяющих преимущества плазмид и фагов. Космиды — это плазмиды, содержащие специфические участки, называемые Когда решается вопрос о том, в какую область вектора ввести клонируемый фрагмент, необходимо учитывать, что вставка в функционально важную последовательность неизбежно нарушит какое-либо из свойств вектора. Впрочем, такое нарушение может быть использовано в целях селекции рекомбинантных молекул. Например, широко распространенный плазмидный вектор (см. скан) Рис. 36.3. Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных или химерных молекул ДНК. Введенная обратно в бактериальную клетку (при трансформации) плазмида реплицируется, а вместе с ней реплицируется и последовательность-вставка. Поскольку воссоединение липких концов реконструирует сайт узнавания рестриктазы, клонированный фрагмент может быть легко выделен из рекомбинантной плазмиды при помощи той же рестриктазы. Если при этом использовать смесь всех фрагментов, образованных в результате расщепления тотальной ДНК человека одной и той же эндонуклеазой, то при помощи клонирующих плазмид можно получить около миллиона различных рекомбинантных молекул ДНК, каждая из которых дает начало индивидуальному бактериальному клону. (Modified and reproduced, with permission, from Cohen SN: The manipulation of genes. Sci. Am. [July] 1975; 233: 34.) Таблица 36.3. Широко распространенные векторы для клонирования
становятся чувствительными к этому антибиотику (рис. 36.4). Это позволяет легко отличить исходную плазмиду, обеспечивающую устойчивость бактерии-хозяина к обоим антибиотикам, от рекомбинантной формы. Чтобы получить еще более четкие доказательства того, что плазмидная ДНК действительно является химерной (несет вставку), можно сравнить размеры сконструированной плазмиды с исходной методом гель-электрофореза. Рекомбинантная плазмида, естественно, будет иметь больший молекулярный вес. Геномные библиотеки и их конструирование Подобрав соответствующие условия клонирования, можно добиться того, что в наборе клонированных фрагментов будут содержаться практически все гены данного генома. Такие коллекции клонов, полученные для конкретного генома, называют геномными библиотеками. Геномная библиотека готовится из тотальной ДНК клеточной линии или ткани. В отличие от геномной библиотеки библиотека кДНК представляет популяцию мРНК в ткани. Геномная библиотека готовится методом частичного расщепления тотальной ДНК какой-либо «мелкощепя-щей» рестриктазой (например,
Рис. 36.4. Метод выявления рекомбинантных молекул ДНК. Фрагмент ДНК встроен в уникальный требуемых для создания представительной библиотеки, обратно пропорционально размеру клонируемых фрагментов, но прямо пропорционально размеру генома (табл. 36.4). Библиотека генома человека, состоящая из 10 6 клонов со встроенными достаточно протяженными фрагментами, с вероятностью около 99% содержит любой уникальный ген. Получение такой библиотеки обеспечивает высокую вероятность выявления интересующего гена. Библиотека Векторы, обеспечивающие синтез белка, кодируемого клонированным геном, называют экспрессирующими. Такие векторы широко используют для выявления специфических кДНК молекул в кДНК-библиотеке, а также для наработки генно-инженерных белков. Специально сконструированные экспрессирующие векторы имеют, как правило, сильный индуцибельный промотор, кодоны инициации Таблица 36.4. Состав представительных геномных библиотек
трансляции для всех возможных рамок считывания, терминаторы транскрипции и трансляции и, если необходимо, определенные сигналы процессинга белка. Некоторые экспрессирующие векторы содержат гены ингибиторов протеаз, что увеличивает выход продукта экспрессируемого гена. Для конструирования библиотек кДНК весьма часто используется вектор ЗондыДля выявления специфического клона в составе геномных или кДНК-библиотек, а также при количественном определении ДНК или РНК используются различные типы молекулярных зондов. Как правило, зонды ( Блоттинг и техника гибридизацииДля визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других «примесных» молекул используется комбинация целого ряда экспериментальных приемов, которые в совокупности получили название «блоттинг». На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузерн-блоттинга (для визуализации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттинга (для РНК) и Вестерн-блоттинга (для белков). Первая процедура названа по имени автора методики, остальные возникли как лабораторный жаргон, но со временем стали общепринятыми терминами. Первая методика полезна при определении количества копий гена (копийности) в данной ткани или при выявлении значительных структурных изменений в генах (делеции, вставки или перегруппировки). Иногда даже удается выявить точковую мутацию, если она затрагивает сайт рестрикции. Нозерн- и Вестерн-разновидности блоттинга используются для определения молекулярных размеров и количества специфических РНК и белковых молекул. Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. После лизиса и денатурации под действием Все разновидности методов гибридизации, рассмотренные в этой главе, базируются на вышеупомянутых специфических взаимодействиях пар оснований комплементарных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибридизующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного комплекса, устойчивого к высокой температуре в ходе гибридизации и отмывки. Такие комплексы устойчивы также и при низкой концентрации соли. Комплексы, образующиеся при относительно более слабом соответствии структуры цепей, в «жестких» условиях (высокая температура или низкая концентрация соли) менее устойчивы. При этом гибридизация либо не происходит вовсе, либо гибридный комплекс разрушается при отмывке. Генные семейства, у которых наблюдается некоторая степень гомологии, можно выявить варьированием условий гибридизации и отмывки. Этот же подход применяется и при сравнении аналогичных генов разного видового происхождения. Определение последовательности ДНК (секвенирование)В настоящее время разработаны методы определения полной нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 36.6). При решении этой задачи необходимо
Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизующимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью специфических антител или других молекулярных зондов. иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осуществить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод — метод Сэнгера базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога.
|
1 |
Оглавление
|