24.14. ДНК-полимераза I исправляет ошибки в ДНК

ДНК-полимераза обладает еще одним видом ферментативной активности: в определенных условиях она способна расщеплять цепи ДНК. ДНК-полимераза постепенно гидролизует цепь ДНК с 3-гидроксильного конца. При этом отщепляются мононуклеотиды. Таким образом, ДНК-полимераза I является также -экзонуклеазой (рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должен иметь свободный 3-ОН-конец и не должен находиться в составе двойной спирали. Является ли такая экзонуклеазная активность фермента нежелательным побочным эффектом, или она каким-то образом участвует в биологическом действии ДНК-по-лимеразы? Эксперименты с использованием химически синтезированных полинуклеотидов с некомплементарным остатком на конце затравки показали, что -экзонуклеазная активность выполняет в процессе полимеризации функцию редактирования. Рассмотрим полимер, показанный на рис. 24.28, в котором последовательность остатков образует двойную спираль с более длинным полимером На 3-конце этой poly(dT)-последовательности имеется один остаток который

не образует водородных связей, так как он не комплементарен dA. При добавлении ДНК-полимеразы и dTTP этот некомплементарный остаток отщепляется раньше, чем начинается присоединение остатков Эксперименты с использованием множества различных синтетических полимеров показали, что ДНК-полимераза I всегда удаляет некомплементарные остатки на конце затравки, прежде чем продолжать полимеризацию. Если на конце находится комплементарное основание и в среде присутствуют активированные предшественники, гидролиза практически не происходит. Полимеризация предотвращает гидролиз с 3-конца.

По всей вероятности, репликация ДНК идет с высокой точностью, так как спаривание оснований проверяется дважды. В тех случаях, когда пара оснований не вмещается в двойной спирали, полимеризация обычно не идет. Однако, если на этом этапе все-таки произойдет ошибка, она может быть исправлена раньше, чем будет присоединен следующий нуклеотид. Таким образом, ДНК-полимераза I проверяет результат каждого проведенного акта полимеризации, прежде чем перейти к следующему.

Кроме того, ДНК-полимераза I может гидролизовать ДНК, начиная с -конца цепи. Эта -нуклеазная активность (рис. 24.29) существенно отличается от обсуждавшейся выше -экзонуклеазной активности. Во-первых, расщепляемая связь должна находиться в двухспираль-ном участке. Во-вторых, может происходить расщепление как концевой фосфодиэфирной связи, так и связи, расположенной на расстоянии нескольких нуклеотидов от -конца (который может иметь свободную или фосфорилированную гидроксильную группу). -третьих, -нуклеазная активность увеличивается, если одновременно идет синтез -четвертых, активный участок -нуклеазной активности четко отделен от активных участков полимеризации и -гидролиза. ДНК-полимеразу I можно расщепить протеолитическими ферментами на фрагмент с массой содержащий всю -нуклеазную активность, и фрагмент с массой содержащий всю полимеразную и всю -экзонуклеазную активности. Таким образом, ДНК-полимераза I содержит по меньшей мере два различных фермента в одной полипептидной цепи.

Рис. 24.28. -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы

Рис. 24.29. -нуклеазная активность ДНК-полимеразы

-нуклеаза дополняет -экзонуклеазную активность, исправляя ошибки другого рода. Например, -нуклеаза участвует в вырезании

Рис. 24.30. ДНК-лигаза катализирует соединение двух цепей ДНК, входящих в состав одной двухспиральной молекулы.

Рис. 24.31. Ковалентный промежуточный комплекс фермент-AMP.

пиримидиновых димеров, образующихся при облучении ДНК ультрафиолетом (разд. 24.24). Более того, -нуклеазная активность играет ключевую роль в самой репликации ДНК (разд. 24.19).