Глава 3. МИТОТИЧЕСКИЙ И КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛЫ

Прокариоты

В метаболической системе клетки, описанной в гл. 2, концентрации ферментов, входящие в уравнения как параметры, остаются постоянными в течение времени порядка времен релаксации метаболических систем. В эпигенетической же системе активности ферментов и концентрации мРНК и рРНК становятся переменными, подобно концентрациям метаболитов, в то время как «концентрации» генов остаются постоянными, определяя некоторые из параметров. В следующем приближении «концентрации» генов считаются изменяющимися и основное внимание уделяется управлению репликацией ДНК и связанным с этим явлениям в митотическом и клеточном циклах. Как показано в гл. 2, длительности митотического цикла и эпигенетических процессов сильно перекрываются, поэтому проводить различие между ними на основании характерных времен релаксации нецелесообразно. К тому же мы увидим, что управление репликацией ДНК, по-видимому, происходит в основном согласно тем же принципам, что и регуляция активности генов. Это не удивительно, так как ДНК является не более чем одним из видов макромолекул. Поэтому мы включим митотический и клеточный циклы в категорию эпигенетических управляющих процессов. Будем считать, что запас генетической информации остается неизменным, т. е. исключаются мутации и такие процессы, как кроссинговер, инверсии, дупликации и т.д., которые могли бы влиять на объем генетической информации и ее доступность. Эти процессы рассматриваются как источник изменений на следующем уровне функционального анализа клеток и организмов, определяя генетическую систему в целом. Я не буду останавливаться на них подробно, потому что эти процессы, по-видимому, подчиняются принципам, совершенно отличным от принципов регуляции активности: согласно существующим представлениям, изменения в генетической информации рассматриваются только как результат чисто случайных событий, которыми клетки и организмы управляют незначительно или не управляют совсем.

Я остановлюсь сначала на клеточном цикле прокариотов ввиду его сравнительной простоты и наличия достаточно

детальной информации, позволяющей построить молекулярную модель. Так как цикл не имеет ни начала, ни конца, исходная точка должна выбираться согласно некоторому функциональному критерию, который надежно отражает существенную особенность внутриклеточного процесса. Цикл развития бактерий имеет две такие точки: первая — момент разделения двух дочерних клеток и вторая — момент инициации репликации ДНК. Хотя первая из них удобнее с точки зрения эксперимента, вторая оказывается функционально более адекватной. Отклонения в инициации репликации ДНК значительно меньше, чем во времени начала разделения клеток; это указывает на то, что первый процесс гораздо более критичен для клеток, чем второй.

До сих пор мы совсем не говорили о пространственной структуре и цитологии клеток, если не считать краткого упоминания о мембране в связи с lac-опероном. Характерная особенность подхода к функционированию клеток, основанного на теории управления, состоит в том, что, поскольку речь идет о динамике клетки, очень важной переменной является время; понятие же пространства в таком подходе практически отсутствует. Клетку можно рассматривать как сферу, ограниченную мембраной, и считать, что все составные части — ДНК, РНК, белки и метаболиты — равномерно распределены внутри этой сферы. Но начиная с момента, когда речь идет о клеточном цикле, необходимо ввести некотрые минимальные пространственные ограничения. Эти ограничения станут более значительными позже, в связи процессами развития, когда вместо обыкновенных дифференциальных уравнений должны будут использоваться уравнения поля, включающие пространственные переменные. В данный момент отметим только, что в популяциях бактерий, растущих в однородных благоприятных условиях, клетки имеют одинаковые размеры в любой исходной точке клеточного цикла, показывая, что они способны в каком-то смысле измерять свой собственный объем и разделять его на примерно равные половины при делении. Бактерии, преимущественно используемые для изучения клеточного цикла, — Е. coli и Salmonella typhimurium — по форме близки к цилиндрам и растут вдоль продольной оси. Первый признак разделения — это появление кромки, названной перегородкой, которая идет по поверхности цилиндра на уровне середины продольной оси. Положение этой перегородки, по-видимому, точно контролируется, так что клетка имеет некоторую пространственную информацию, которую она использует для определения локализации этой структуры (Walker, Pardee, 1968).

Нормальные временные связи между репликацией ДНК и клеточным делением могут изменяться под действием различных факторов, показывая, что эти события не связаны причинно

каким-либо жестким образом. Например, бедная среда, отсутствие пенициллин, кристаллический фиолетовый, ультрафиолетовое и рентгеновское излучение — все это препятствует формированию перегородки и поэтому останавливает клеточное деление, а репликация ДНК и общий рост продолжаются. В результате формируются очень длинные клетки в виде нитей. Репликацию ДНК можно разобщить с ростом также и с помощью митомицина С, фенетола или при исключении из инкубационной среды тимина; при этом происходит значительный рост клеток, а ДНК не синтезируется (Pardee, 1968). Существуют мутанты, в которых клеточное деление и разъединение дочерних клеток продолжаются в отсутствие репликации ДНК; при этом образуются клетки, не содержащие ДНК. Такие клетки не могут, конечно, жить очень долго (Adler et al., 1967; Inoye, 1969). Все эти факты показывают, что периодические явления инициации репликации ДНК и инициации формирования перегородки способны к автономной цикличиости; таким образом, они имеют свои собственные механизмы управления или же оба процесса управляются с помощью внешнего осциллятора.

Так как бактериальная хромосома представляет собой замкнутую кольцевую ДНК длиной около 1,3 м, то, по-видимому, разумно было бы предположить, что в основе биологических часов лежит циклическое движение процесса репликации по хромосоме со скоростью, пропорциональной скорости роста бактерии. Однако есть данные, которые решительно противоречат этому (Yoshikawa, 1967). Быстро растущие бактерии повышают общую скорость репликации ДНК не увеличением скорости включения в точке роста, а увеличением числа растущих точек, инициируя второй цикл репликации прежде, чем закончится первый. Таким образом, часы должны скорее иметь характер осциллятора, управляющего событиями инициации с помощью циклических изменений концентрации, а не представлять собой автоматическое перемещение по замкнутой направляющей. Далее, по-видимому, разумно было бы предположить, что аналогичный осциллятор управляет началом создания перегородки и что между этими двумя осцилляторами в норме существует определенный сдвиг по фазе. В результате этого сдвига образование перегородки начинается после прекращения репликации ДНК, а затем до самого деления проходит время 20 мин (так называемый D-период) (см. работу Helmstetter, Cooper, 1968). Нормальный период времени, необходимый для полной репликации хромосом, С, составляет около 40 мин независимо от скорости роста (Helmstetter, Pierucci, 1968). Эти величины определяют момент инициации репликации ДНК в клетках, растущих с любой данной скоростью. Например, если время удвоения клетки равно 30 мин, то репликация ДНК заканчивается за

20 мин до деления, а инициация происходит за 40 мин до этого, так что инициация репликации хромосом, разделенных между дочерними клетками, совпадает с делением, приведшим к образованию их прародителей. Очевидно, инициации должны происходить в клетках такой культуры каждые 30 мин.

Рис. 3.1. Схематическое изображение клеточного цикла бактерий, показывающее распределение во времени процессов инициации репликации ДНК, возникновения перегородки и деления клетки в 50-мннутном цикле.

Если время генерации изменяется до 50 мин, то инициация репликации ДНК для дочерних клеток происходит за 60 мин до их разделения, т. е. за 10 мин до деления, приводящего к образованию родительской клетки. Таким образом, мы видим, что репликация ДНК может инициироваться в любой момент клеточного цикла, но этот момент для любого заданного времени генерации будет фиксирован.

Эти структурные и временные отношения для 50-минутного клеточного цикла схематически представлены на рис. 3.1. Инициация репликации ДНК происходит в нулевой момент времени (такое же состояние, как при 50 мин) и отмечена появлением второй точки на мембране, примыкающей к месту прикрепления каждой хромосомы. Этот участок определяет начало хромосомы, репликация ДНК инициируется здесь и продолжается в обоих направлениях до тех пор, пока две репликационные вилки не достигнут терминальной точки, расположенной примерно

напротив начала (Masters, Broda, 1971). Поскольку репликация и рост продолжаются, эти участки из-за роста мембраны раздвигаются, разнося, таким образом, дочерние хромосомы в разные стороны. Впервые это было показано Жакобом, Райтером и Кузиным (Jacob, Ryter, Tuzin, 1966) при изучении Bacillus subtilis. Рост мембраны у прокариотов, таким образом, играет роль митотического аппарата (имеющегося у эукариотов), разделяющего дочерние хромосомы. Хромосомы, конечно, представляют собой двойные спирали, а репликация полуконсерва-тивна, но для простоты хромосомы на рисунке изображены в виде одиночных нитей. Окончание репликации хромосом совпадает с началом формирования перегородки. Очень ясное и полное обсуждение этих процессов дано в обзорной статье Доначи, Джонса и Тизера (Donachie, Jones, leather, 1973).