9.13. Существуют обратимые ингибиторы двух типов - конкурентные и неконкурентные

Изучение обратимых ингибиторов ферментов также позволило получить весьма важные сведения о структуре активных центров различных ферментов.

Рис. 9-11. Необратимое ингибирование -фермента иодацетамидом.

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром, но в отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. Отличительная особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата. Например, если при заданных концентрациях субстрата и конкурентного ингибитора активность фермента подавлена на 50° 0, то мы можем уменьшить степень ингибирования, повысив концентрацию субстрата.

По своей трехмерной структуре конкурентные ингибиторы обычно напоминают субстрат данного фермента. Благодаря такому сходству конкурентному ингибитору удается «обмануть» фермент и связаться с ним. Конкурентное ингибирование можно количественно изучать на основе теории Михаэлиса-Ментен. Конкурентный ингибитор I просто обратимо присоединяется к ферменту Е, образуя с ним комплекс

Однако в отличие от субстрата ингибитор не подвергается действию фермента и новые продукты реакции не образуются.

Классическим примером конкурентного ингибирования служит ингибирование сукцинатдегидрогеназы анионом малоновой кислоты (рис. 9-12). Сукцинатдегидрогеназа входит в состав группы ферментов, катализирующих реакции цикла трикарбоновых кислот - конечный метаболический путь окислительного разрушения углеводов и жиров в митохондриях. Этот фермент катализирует отщепление двух атомов водорода от сукцината - по одному от каждой из двух метиленовых групп. Сукцинатдегидрогеназа ингибируется малонатом, который напоминает сукцинат тем, что он также содержит две карбоксильные группы, принимающие при pH 7,0 ионизированную (депротонирован-ную) форму. Однако он отличается от сукцината тем, что в его молекуле имеется только три атома углерода. Сукцинатдегидрогеназа не способна отщеплять водород от малоната, но малонат занимает активный центр фермента, не давая ему возможности взаимодействовать с нормальным субстратом. Малонат является обратимым ингибитором, так как повышение концентрации сукцината при заданной концентрации малоната снижает степень ингибирования фермента.

В качестве конкурентных ингибиторов сукцинатдегидрогеназы могут выступать и другие соединения, содержащие две отрицательно заряженные группы, расположенные на соответствующем расстоянии друг от друга. К ним относится, например, оксалоацетат - промежуточный продукт в цикле трикарбоновых кислот (рис. 9-12).

Рис. 9-12. Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, и ее конкурентное ингибирование. Обратите внимание, что конкурентные ингибиторы напоминают в структурном отношении сукцинат: они содержат две определенным образом расположенные в пространстве отрицательно заряженные группы, которые соответствуют конформации активного центра.

Изучение структурных особенностей всех этих ингибиторов позволило сделать вывод, что в каталитическом центре сукцинатдегидрогеназы находятся две определенным образом расположенные в пространстве положительно заряженные группы, способные притягивать две отрицательно заряженные карбоксильные группы сукцинат-аниона. Таким образом, каталитический центр сукцинатдегидрогеназы оказывается комплементарным структуре своего субстрата (рис. 9-12).

Конкурентное ингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определив влияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу - конкурентному или неконкурентному - происходит обратимое ингибирование фермента (дополнение 9-3), весьма удобно преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в линейную форму. Чаще всего для этой цели используют метод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратных координатах, можно определить также значение константы диссоциации комплекса фермент ингибитор. Для реакции диссоциации

константа диссоциаиии равна