ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Вся информация об отдельных метаболических реакциях, о промежуточных соединениях, образующихся на последовательных этапах различных метаболических путей, а также о механизме регуляции работы катализаторов получена главным образом с использованием очищенных препаратов ферментов. Высокоочищенные препараты ферментов необходимо иметь также и для того, чтобы получить надежные данные о кинетике, кофакторах, активных центрах, о структуре и механизме действия ферментов.

Процесс очистки состоит в выделении данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель-фильтрацией; нуклеиновые кислоты — осаждением путем добавления антибиотика стрептомицина и т.д. Основная проблема — отделить нужный фермент от сотен химически и физически сходных белков.

Классические методы очистки

Широко используются следующие методы очистки: осаждение при различных концентрациях солей (чаще всего сульфата аммония или сульфата натрия), а также органическими растворителями (ацетоном, этанолом); дифференциальная денатурация путем нагревания или изменения pH; дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрация и электрофорез.

Для масштабной и быстрой очистки белков успешно применяются избирательная адсорбция и элюция белков с целлюлозного анионообменника диэтиламиноэтилцеллюзлозы и катионообменника карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется также разделение белков по размерам на молекулярных ситах, например сефадексе. Эти методы являются, однако, относительно малоселективными (если они не используются в сочетании) для отделения индивидуального белка от всех остальных, находящихся в смеси. Такая задача легче решается методом аффинной хроматографии.

Типичная процедура очистки одного из ферментов печени с хорошим выходом и 490-кратной степенью очистки препарата описана в табл. 7.2. Обратите внимание на изменение при очистке удельной активности и выхода фермента. Процедура направлена на то, чтобы достичь максимальной удельной активности (число единиц активности фермента на 1 мг белка) при возможно большем выходе исходной суммарной активности.

Таблица 7.2. Типичная процедура очистки фермента

Метод аффинной хроматографии

Замечательным достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется пблучить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие. После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда. Успешное применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки поразительных результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов.

Чаще всего ферменты проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам и коферментам, поэтому наиболее подходящими лигандами служат производные субстратов и коферментов, ковалентно связанные с носителем, например с сефадексом. Они могут быть присоединены к носителю либо непосредственно, либо через связующую «ножку» (линкер) из 3—8 атомов углерода. Использование линкера помогает разрешить проблемы, связанные с тем, что присоединение лиганда к носителю может препятствовать его взаимодействию с ферментом. Вместе с тем введение гидрофобного линкера иногда осложняет выделение из-за проявления эффектов хроматографии на гидрофобных лигандах (см. Ьиже). Примером успешного применения аффинной хроматографии может служить очистка множества различных дегидрогеназ на аффинных носителях с в качестве лиганда. При этом с лигандом могут связываться несколько дегидрогеназ, которые при элюировании их раствором NADb выходят вместе, и их дальнейшее разделение проводят, используя уже не коферментные, а субстратные аффинные носители или применяя для элюирования «тупиковые тройные смеси», содержащие кофермент, специфический субстрат и специфический продукт.

С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фенилсефароза. В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерического эффектора. Элюирование обычно осуществляют солевым раствором увеличивающейся концентрации.

В случае хроматографии на гидрофобных лигандах к носителю (например, сефадексу) присоединяют алкильные или арильные углеводороды. Связывание белков с такими носителями обусловлено гидрофобными взаимодействиями между алкильными цепями и гидрофобными участками белковой молекулы. Белки наносят в составе растворов с высоким содержанием соли, например и элюируют раствором с понижающейся концентрацией этой же соли.

Определение гомогенности белкового препарата с помощью электрофореза в полиакриламидном геле

Гомогенность белковых препаратов лучше всего устанавливать с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в разных условиях. При одномерном

электрофорезе нативного белка (при наличии достаточного количества препарата) можно обнаружить как основные, так и минорные белковые примеси. В двумерном варианте (по О’Фаррелу) в одном направлении проводят разделение денатурированных белков в соответствии с их значениями (в присутствии мочевины) в градиенте pH, который создается полимеризованными амфолитами. Во втором направлении белки, денатурированные с помощью додецилсульфата натрия, разделяют в соответствии с размерами протомеров (если белок является олигомером).

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Пространственное распределение и клеточная компартментация ферментов, субстратов и кофакторов (см. гл. 2) имеют кардинальное значение. Например, в клетках печени ферменты гликолиза локализованы в цитоплазме, а ферменты цикла лимонной кислоты — в митохондриях.

Распределение ферментов по субклеточным орга-неллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции (см. гл. 2).

Локализацию данного фермента в ткани или клетке часто удается установить гистохимическими методами («гистоэнзимология»). Для этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы замороженной ткани обрабатывают раствором субстрата, к которому специфичен данный фермент. В тех местах, где находится фермент, образуется продукт катализируемой этим ферментом реакции. Если продукт окрашен и нерастворим, он остается на месте образования и позволяет локализовать фермент. Гистоэнзимология дает наглядную и в известной мере физиологичную картину распределения ферментов.