Глава 2. УСТОЙЧИВОСТЬ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Ферментативная адаптация

После исторических работ Пастера о процессе брожения и роли в нем микроорганизмов во Франции начались интенсивные исследования физиологии бактерий. Первое систематическое и всестороннее описание явления ферментативной адаптации можно найти в книге Дюкло, опубликованной в 1899 г. и озаглавленной «Traite de Microbiologie». Поэтому вполне понятно, что исследование этого аспекта клеточной физиологии привело в конце пятидесятых — начале шестидесятых годов к появлению одной из наиболее удачных теорий молекулярной биологии, созданной Ф. Жакобом, Дж. Моно и их коллегами именно в Институте Пастера в Париже.

Как мы отмечали в гл. 1, первое доказательство существования специфических управляющих процессов в бактериальном метаболизме появилось в результате исследований мутантных штаммов, — исследований, совмещающих в себе аналитическую мощь генетики и биохимии. Выяснение механизма бактериальной адаптации также обязано этим методам, примененным с большой изобретательностью и творческой фантазией исследователями из Института Пастера. Интересно отметить, что подробный обзор всех имеющихся к тому времени данных о ферментативной адаптации был опубликован Моно в 1947 г. — через год после выхода статьи Ледерберга и Татума (Lederberg, Tatum, 1946), которые сообщили об открытии половой рекомбинации у Escherichia coli. В этом обзоре Моно на основе имевшихся к тому времени данных о мутантных штаммах делал заключение о том, что «адаптивные возможности» клеток могут подвергаться как очень сильным, так и незначительным мутационным изменениям, которые влияют на отдельный фермент, совершенно не затрагивая «потенциальных свойств» других ферментов, находящихся в тех же цепях превращений. Он предположил, что «специфические свойства каждого фермента определяются независимым наследственным фактором». Далее он продолжает: «Однако следует помнить, что до тех пор, пока не будут применены прямые генетические тесты, эти данные останутся косвенными и неполными. Есть надежда, что блестящее открытие Ледерберга и Татума позволит создать такие тесты».

Лишь десятилетие спустя Жакобу и Моно удалось объяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе генетических управляющих процессов в бактериях. Использование мутантов и рекомбинантов позволило получить убедительные доказательства существования свойств генетического аппарата, предвиденных Моно, и глубоко проникнуть в новый мир транскрипции, трансляции и молекулярных принципов регуляции у прокариотов.

Основные черты процесса адаптации устанавливаются очень легко. Если культура бактерии, например Escherichia coli, растущая на минимальной солевой среде, обеспечивается смешанным источником углерода, скажем глюкозой и лактозой, то первоначально имеет место экспоненциальный рост, а затем совершенно неожиданно рост прекращается (рис. 2.1). Это плато на кривой роста занимает примерно 50—60 мин, и затем рост возобновляется со скоростью, фактически равной первоначальной скорости роста.

Было показано, что во время второй фазы роста присутствует фермент, которого не было во время начальной фазы. Это -галактозидаза; ее роль заключается в расщеплении -галактозидной связи лактозы, что дает гексозы — глюкозу и галактозу. В действительности имеется еще два фермента, которые тоже появляются во время адаптационного периода: Р-галактозидпермеаза и -галактозидацетилаза; оба эти фермента обусловливают транспорт лактозы через клеточную мембрану в клетку, где она может быть катаболизирована. Очевидно, во время начальной фазы роста клетки потребляют исключительно глюкозу, так как лактоза не может проникнуть в клетку до тех пор, пока не будут синтезированы ферменты, необходимые для ее транспорта. Только после того, как запасы глюкозы будут исчерпаны, что легко показать экспериментально, клетки действительно начнут приспосабливаться к использованию лактозы, синтезируя три новых фермента. Эти факты ставят два основных вопроса, касающихся ферментативной адаптации: (1) какие молекулярные процессы вовлечены в индукцию новых ферментов в клетке при заданных изменениях окружающей среды и (2) почему, несмотря на наличие индуктора (лактозы), синтез этих ферментов не идет в присутствии глюкозы?

Как показано в предыдущей главе, непосредственно из времени адаптации следует, что мы имеем дело с более медленным процессом, чем изменение состояния метаболической системы. Уже одно это говорит о том, что вряд ли ферментативная адаптация состоит просто в активации исходно существующего фермента, присутствующего в клетках в неактивной форме, поскольку, согласно предыдущей главе, такие взаимодействия должны происходить в течение секунд или даже меньше.

Однако это необходимо было подтвердить независимо, например методами, аналогичными тем, которые описаны Спигельманом (Spiegelman, 1948), показавшим, что фракции супернатанта из прокипяченых экстрактов адаптированных дрожжей не могут активировать белковые экстракты из неадаптированных дрожжей, а также иммунологическими методами, описанными Коном и Торриани (Cohn, Torriani, 1952), которые показали, что в неадаптированных бактериях нет белка, который бы давал перекрестную реакцию с антителами к очищенной -галактозидазе.

Рис. 2.1. Двухфазная кривая роста бактериальной культуры, развивающейся на смеси субстратов, глюкозы и лактозы, источников углерода. Во время первой экспоненциальной фазы роста потребляется только глюкоза, а во время второй — только лактоза. Во время промежуточной фазы, когда нет роста, происходит адаптация.

Эти и другие исследования, например включение меченых аминокислот в -галактозидазу в период индукции, позволили установить, что ферменты в ходе адаптации были синтезированы de novo. Но для того, чтобы быть уверенным, что отдельные клетки изменяли свое физиологическое состояние от неадаптированного к адаптированному, необходимо было исключить возможность того, что в популяции в ответ на изменение условий питания происходит генетическая селекция. В действительности эта возможность уже была исключена Моно (Monod, 1947), а кроме того, чтобы получить веские доводы в пользу первого объяснения и против гипотезы селекции мутантов, достаточно просто рассмотреть временной масштаб. Бактерии, растущие на минимальной солевой среде плюс источник углерода (глюкоза или лактоза), имеют время генерации около 50 мин — примерно такое же, как время, необходимое для ферментативной индукции. Таким образом, за это время может быть отобрано лишь одно поколение мутантной линии, и если

дальнейший рост культуры был обусловлен только мутантным штаммом, скорость роста не могла бы быть такой же, как до индукции. Мы используем здесь такой же подход, что и в предыдущей главе для идентификации метаболической системы с помощью рассмотрения времен метаболических превращений, которые ограничены снизу числами оборотов ферментов, а сверху — временами, необходимыми для изменения концентраций ферментов. Идентифицируем теперь следующую систему в иерархии, связанную с ферментативной адаптацией, ограничивая ее снизу метаболической системой, в которой имеют место такие явления, как ферментативная активация и ингибирование, а сверху — генетической селекцией, для осуществления которой необходимо несколько поколений. Ферментативная адаптация происходит в течение времени жизни одного поколения и поэтому не представляет собой генетического явления. Это явление эпигенетическое в том смысле, что оно состоит в изменении активности генов, а не основано на генных мутациях и селекции. Поэтому мы можем называть рассматриваемую нами систему эпигенетической системой клетки. Очевидно, время ее ответа лежит в интервале от нескольких минут до часа. Время ответа генетической системы должно определяться временем нескольких генераций и для микроорганизмов равно нескольким часам. Для организмов с более длительным временем генерации время ответа или характерные времена для различных систем будут соответственно другими. Мы увидим далее, что у более сложных организмов эпигенетические системы помимо индукции и репрессии генов включают многие другие процессы, но индукция и репрессия всегда остаются основной особенностью эпигенеза.