Мембраны и морфогенез

В настоящее время твердо установлено, что биологические мембраны — это нечто большее, чем просто фазовые границы между органеллами и цитоплазмой или между цитоплазмой и внешней средой. В основе наших представлений о структуре мембраны до сих пор лежит классическая липопротеидная модель Давсона и Даниэлли (Davson, Danielli, 1952) с липидным бислоем, покрытым с обеих сторон белком. Однако теперь мы знаем о мембранах гораздо больше благодаря работам Брет-шера (Bretscher, 1971), обнаружившего белки, которые «прошивают» мембрану, и исследованиям, показывающим, что многие ферменты, например аденозинтрифосфатаза, дегидрогеназа и аденилатциклаза, связаны с мембраной и наиболее эффективно функционируют в этом состоянии (см., например, Porcellati, di Jeso, 1971; Siekevitz, 1972). Таким образом, помимо известных свойств: возбудимости и избирательной ионной проницаемости, мембрана обладает еще одной особенностью — с ней связана

значительная метаболическая активность. Электрическая возбудимость — хорошо известное свойство многих биологических мембран, но его нужно рассматривать только как одну из форм возбудимости, которая включает также метаболическую активность. Тем самым подразумевается, что присутствие аллостерических ферментов, которые способны активироваться и ингибироваться диффундирующими лигандами, может привести к появлению в мембранах волн активности, аналогичных распространяющимся потенциалам действия, но не обязательно сопровождающихся деполяризацией мембраны и потоком ионов через нее.

Рассмотрим простую модель метаболически возбудимой мембраны, на основе которой можно объединить морфогенетические явления, уже описанные в этой главе, и которую мы сможем затем использовать для анализа более сложных морфогенетических систем, рассматриваемых позже.

Рис. 5.4. Схема взаимодействий молекулярных процессов в мембране или кортикальном слое, которые могут привести к образованию градиента метаболита V, связанного с белками В.

Предположим, что имеется фермент , который связан с мембраной или кортикальным слоем клетки, и активные центры этого фермента обращены во внутриклеточное пространство (рис. 5.4). Он катализирует превращение метаболита U в другой метаболит V. Второй фермент, который может быть, а может и не быть связан с мембраной, катализирует реакцию превращения V в W. Предположим, что метаболит V вызывает увеличение концентрации активатора фермента (на рисунке он обозначен через S). Этот активатор может высвобождаться из центров связывания с помощью V или, если это ион, скажем его концентрация может увеличиться в результате изменения проницаемости мембраны с помощью метаболита V или за счет другого изменения локального ионного равновесия. Активация приводит к образованию петли положительной обратной связи: чем больше производится V, тем больше появляется свободного S и тем больше будет активация что приведет к образованию еще большего количества V. Это может вызвать

метаболитное возбуждение, так как если свободный S кратковременно появится в некоторой точке мембраны, то волна активации из этой точки сможет распространяться вдоль мембраны. Для стабилизации процесса нужно предположить, что W — это ингибитор Легко видеть, что структура системы управления качественно аналогична той, которая рассматривалась в гл. 1 в связи с гликолитическим осциллятором (рис. 1.10), и что система, описанная выше, может вызвать колебания концентраций метаболитов, т. е. волна возбуждения способна спонтанно возникнуть вновь в том же месте. Если один из лигандов, участвующих в управлении, оказывается ионом, то волна сопровождается электрическим сигналом; в противном случае это электрически нейтральный метаболический процесс.

Следующий вопрос — как получается перераспределение вещества при прохождении волны активности, приводящее к образованию устойчивого градиента связанного метаболита, который дает пространственно упорядоченный «след» волны. Предположим, что на мембране существуют центры связывания метаболита V, обозначенные на рис. 5.4 через В, и что эти центры активируются веществом W; тогда после прохождения волны связанный метаболит V каким-то образом распределится по мембране. Для того чтобы гарантировать, что морфоген, в нашем случае вещество V, связанное с центрами В в мембране или кортексе, будет иметь максимальную концентрацию в источнике волн, а в других местах его концентрация будет монотонно уменьшаться, нужно сделать некоторые очень простые предположения. Например, можно допустить, что существует некая задержка между образованием метаболита V и активацией центров В; в этом случае мы будем иметь монотонный градиент, что показано в приложении. Эту задержку получить очень просто, предположив, что превращение V в W происходит медленно и что для активации центров существует пороговое значение W. Другой вариант — это предположить, что S действует как ингибитор В и как активатор . Тогда по мере распространения волны вещество S (которое, согласно предположению, является ионом) будет почти равномерно накапливаться в системе из-за большой константы диффузии и постепенно ингибировать реакцию связывания. Степень ингибирования в любой момент времени, а следовательно для любой пространственной локализации волны активности, зависит от объема системы, так как S накапливается со скоростью, обратно пропорциональной объему, в котором он диффундирует (предполагая, что границы замкнуты). Это обусловливает чувствительность механизма к разме рам. Поведение таких систем сейчас интенсивно изучается; это позволит лучше понять их регулирующие свойства, на которых подробнее мы остановимся ниже.

Вообще говоря, одна волна активности не создаст устойчивого морфогенетического градиента. Для этого требуется регулярное повторение волн, периодически исходящих из некоторого источника. Наличие этой периодичности в активности источника, который теперь действует как пейсмекер или организационный центр систем, в действительности предполагалось при описании основной кинетической схемы, представленной на рис. 5.4. Мы отмечали, что структура обратных связей процессов управления, действующих на такова, что изменение переменных может носить колебательный характер, причем период колебаний определяется главным образом скоростью исчезновения ингибитора W в результате деградации и диффузии. Поскольку связанный метаболит тоже высвобождается с конечной скоростью, из этой более общей модели видно, что градиент на мембране будет поддерживаться в результате установления равновесия между образованием метаболита в результате прохождения волн, которые распространяются из источника, и его высвобождением из комплекса с мембранным белком. Такая система, конечно, лабильна и пластична и может или сохранять свою собственную структуру в отсутствие внешних воздействий, или отвечать на эти воздействия, изменяя пространственную упорядоченность.

Рассмотренная здесь волновая модель относится к категории систем, для которых существует решение в виде распространяющейся волны, аналогично тому, как это имеет место для уравнений реакций с учетом диффузии типа уравнений (5.1). В настоящее время эта область бурно развивается, и вполне возможно, что экспериментальное исследование волновых режимов в развивающихся системах вместе с аналитическим изучением модельных систем приведут к созданию нового интересного подхода к пониманию эмбриологических процессов. Модель мембраны рассматривалась нами здесь чисто феноменологически, поскольку мы заранее предположили возможность распространения волны в мембране и затем использовали это положение для анализа образования градиента. Сейчас в литературе имеется достаточно много примеров как экспериментальных, так и теоретических систем, обладающих свойствами распространения волн, чтобы считать это свойство твердо установленным для химических и биохимических систем. Ряд таких примеров можно найти в сравнительно недавно вышедшем сборнике материалов симпозиума Фарадеевского общества (Faraday Society Symposium, 1974), который представляет собой своевременный обзор работ в этой очень интересной области исследований.

Посмотрим теперь, как явление распространения волн и его связь с образованием градиентов согласуются с данными, известными для некоторых развивающихся систем, дающих представление

о самых ранних событиях, которые связаны с образованием полярной упорядоченности.

Литоральные водоросли, Fucus и Pelvetia, обладают сферическими яйцеклетками диаметром около 70 мкм, которые оплодотворяются крошечными спермиями после выбрасывания в море. В яйцеклетках в это время нет никаких признаков существования полярной оси. После оплодотворения яйцеклетки погружаются в воду и прикрепляются к любому доступному основанию (обычно к камням) с помощью клейкого мукополи-сахарида, который они выделяют. Оплодотворение или партено-генетическая активация этих яйцеклеток легко осуществляются в лаборатории. Первый признак асимметрии появляется примерно через 15 ч после оплодотворения — у одного полюса яйцеклетки образуется нарост. Яйцеклетка становится грушевидной и затем делится под прямым углом к продольной оси, давая маленькую, ризоидную клетку, которая включает нарост, и большую, талло-мическую. Первая развивается в корневище (ризоид) растения, а последняя — в листья (пластинки).

К появлению этой полярной оси может привести целый ряд воздействий. Так, Лунд (Lund, 1923) обнаружил влияние на этот процесс электрического поля, а Вайтейкер (Whitaker, 1938) выявил зависимость от градиента pH. В число таких стимулов входят температурный градиент и освещение. Согласно другим работам (Jaffe, 1966, 1968), ризоидный полюс становится отрицательно заряженным по отношению к таллому, т. е. через яйцеклетку идет ток. Автор полагает, что это и есть первоначальная поляризующая сила, которая образует градиент вещества в яйцеклетке с помощью процесса внутреннего катафореза; при этом электрически заряженные молекулы пространственно распределяются внутри яйцеклетки. Есть веские данные, что центром начальной полярной упорядоченности является именно мембрана.

Волновая модель, описанная выше, может легко объяснить эти факты. Так, для объяснения электроотрицательности ризоида, можно предположить, что связанный метаболит V обладает деполяризующим действием на мембрану, и считать, что волна возникает в той части яйцеклетки, которая приводит к образованию ризоида, так что в этой точке уровень связанного V максимален. Это находится в соответствии с данными, показывающими, что если яйцеклетки помещены в градиент то ризоид развивается по направлению к максимуму градиента, и согласуется с фактом влияния электрических полей и градиентов pH. Действие света не объяснено, хотя можно предположить, что световые рецепторы вызывают в мембране гиперполяризацию, так как ризоид растет в противоположную от света сторону.

Интересными являются данные о регистрации спонтанного потенциала действия в развивающихся яйцеклетках Pelvetia,

который периодически повторяется, возникая в ризоиде (Nucitelli, Jaffe, 1974). Подобный потенциал действия имеет место и в регенерирующих сегментах Acetabularia (Novak, Bentrup, 1972), причем электрический сигнал возникает у верхушки. Импульсная активность появляется почти через 12 ч после декапитации и имеет довольно нерегулярную периодичность, примерно 1 импульс в 1 ч, а во время регенерации период уменьшается примерно до 10—20 мин. Экспериментальных доказательств того, что эти электрические волны каким-либо образом связаны с установлением градиентов вещества в развивающихся системах, пока нет, но мы сейчас занимаемся исследованиями этого вопроса. Совершенно ясно, что между поведением Pelvetia и Acetabularia и свойствами, предсказываемыми волновой моделью образования градиентов, имеется соответствие.

Посмотрим теперь, как можно применить эту модель, соответствующим образом модифицировав ее, к поведению миксамеб Dictyostelium discoideum. Предположим, что и что одним из изменений в состоянии клетки в условиях голодания оказывается появление возбудимости мембраны вследствие увеличения в ней концентрации или изменения отношения внутри клетки. Допустим, что цАМФ, сигнал хемотаксиса, обладает способностью тем или иным образом инициировать волну активности, например изменяя проницаемость мембраны для иона, который влияет на содержание свободного внутри клетки. Тогда результатом действия цАМФ будет увеличение концентрации свободных ионов калия внутри клетки.

Волна активности в миксамебе должна распространяться быстрее, чем идет процесс диффузии хемотактического сигнала, скорость которого, по оценкам, равна примерно 40 (Gerisch, 1968), поскольку в противном случае все участки мембраны амебы будут активироваться диффундирующим сигналом, прежде чем распространится волна и успеет установиться градиент, и тогда не будет источника волн. Мейнарт и Гирер (Meinhardt, Gierer, 1974) не учли этого при обсуждении приложения их модели к амебам Dictyostelium. Волна активности, распространяющаяся со скоростью, большей чем 40 , может быть аналогична волне, вызывающей активацию фермента в мембране, но скорее всего она является по своей природе чисто ионной, классического электрохимического типа, как в нейроне. Чтобы получить градиент в результате прохождения такой волны, можно предположить, что связанные мембраной белки В (рис. 5.4) способны повышать уровень натрия, который затем играет роль диффундирующего метаболита V. Таким

образом, по мере распространения волны деполяризации вдоль мембраны от места, где впервые была получена сверхпороговая концентрация цАМФ, за ней будет оставаться «след» в виде связанного с мембраной градиента концентрации натрия. Кроме того, связанный с мембраной градиент натрия может сам отвечать за полярность амеб, так как псевдоподии чаще образуются в частично деполяризованных областях мембраны (повышение внутриклеточной концентрации натрия вызывает деполяризацию). Или наоборот, связанные с мембраной ионы натрия могут оказывать на образование псевдоподий опосредованное влияние с помощью некоторой системы взаимодействий внутри мембраны, приводящей к ослаблению связей между структурными элементами с последующим перетеканием цитоплазмы в псевдоподии. В любом случае мы имеем поляризованную амебу, которая будет стремиться двигаться по направлению к источнику цАМФ. Механизм поляризации достаточно лабилен, и его существование определяется устойчивостью градиента на мембране, так что реполяризация в ответ на сигнал может произойти сразу, как только амеба отклонится от курса.

Между моментом приема амебой сигнала цАМФ и импульсным выделением цАМФ из клетки существует задержка около 15 с. Какие процессы управляют генерацией импульса — внутриклеточный синтез цАМФ или механизмы высвобождения, включающие разрыв везикул, содержащих вещество, как это имеет место в процессе нейропередачи в нейронах, не ясно.

На более поздних стадиях агрегации образуются межклеточные контакты. Они необходимы для формирования и развития слизевика (Beug et al., 1973), и из поведения отдельных амеб во время агрегации видно, что одной из причин существования у них полярности оказывается дифференциальное распределение адгезивных участков по всей клетке, причем устойчивый контакт образуется, как правило, между передней частью одной клетки и задней другой. Таким образом, еще одним следствием существования градиента, который, как постулировано, образуется внутри отдельных клеток, должно быть полярное распределение мембранных белков, действующих как адгезивные единицы на клеточной поверхности. Как только клетки образовали контакт, волны могут распространяться непрерывно от клетки к клетке, поскольку система благодаря наличию щелевых контактов оказывает слабое сопротивление проходящим по ней ионным сигналам. Если бы соединение V могло диффундировать через эти контакты, градиент мог бы образоваться на протяжении всего организма. Периодический режим сохранялся бы во всем слизевике, а доминирующую роль играла бы верхушка, которая, согласно Рубину и Робертсону (Rubin, Robertson, 1975), действует как организатор. Модель, использующая полярное

распределение «контакт-чувствительных» молекул на мембранах амеб как основу для образования градиента цАМФ на протяжении всего слизевика, предложена Мак-Мэйхоном (McMahon, 1973). Слабость этой модели — в ее неспособности объяснить регуляцию после разрезания слизевика пополам и в необходимости вводить довольно специальные начальные условия для того, чтобы получить такое же отношение споры стебель (2:1), как в нормальных слизевиках.