Индукция и репрессия генов

Тот факт, что три фермента, участвующие в метаболизме лактозы (р-галактозидаза, -галактозидацетилаза и пермеаза), всегда присутствуют или отсутствуют вместе и в клетках дикого типа встречаются в одних и тех же пропорциях, наводит на мысль, что, какова бы ни была природа процесса управления, он всегда действует на три гена, кодирующие синтез трех ферментов, в той или иной степени единообразно или координированно. Вся система в целом называется lac-оперон. Это единица эпигенетического управления; этимология термина восходит к идее о единой системе, управляемой одним оператором. Как установлено выше, ключом к раскрытию механизма адаптации послужили генетические методы. Были найдены мутантные линии Е. coli, которые непрерывно синтезировали -галактозидазу и два других фермента независимо от присутствия

глюкозы или отсутствия лактозы. Такие клетки, потерявшие свойство индуцируемости лактозой, были названы конститутивными мутантами. Конъюгируя их с клетками дикого типа, можно было получать частичные диплоиды, гетерозиготные по индуцируемости, и исследовать их свойства. Было обнаружено, что исходные мутанты, имевшие конститутивный фенотип (всегда синтезирующие ферменты независимо от условий питания), распадаются на два класса, в одном из которых гетерозигота вела себя подобно клетке дикого типа, т. е. была индуцибельна, в то время как гетерозигота другого класса сохраняла конститутивный фенотип. Мутанты первого класса обозначили стремясь подчеркнуть, что свойство индуцибельности лактозой у них каким-то образом нарушено. Тогда гетерозигота имеет характеристики дикого типа, так как ген дикого типа является доминантным.

Другой конститутивный тип был обозначен что указывает на наличие какого-то дефекта в рабочей части (operative part) системы управления. Этот дефект не исправляется введением в клетку, несущую гена дикого типа Генетическое картирование показало, что эти два участка различны, но расположены в хромосоме Е. coli на небольшом расстоянии друг от друга. Кроме того, было обнаружено, что ген на генетической карте находится очень близко к структурным генам трех ферментов, в то время как ген расположен несколько дальше от них (для него характерна более высокая частота рекомбинации).

Доминирование над сразу наводит на мысль, что ген детерминирует синтез некой молекулы, которая диффундирует в клетке и исправляет недостаток в работе другой хромосомы. Ген на таких расстояниях никакого действия не оказывает. Действительно, было показано, что влияет только на структурные гены в той же хромосоме, позволяя им производить три фермента, участвующие в катаболизме лактозы. Таким образом, проявляет себя только в цмс-положении. Если хромосома, несущая гены lac-оперона дикого типа, присутствует в клетке с мутацией на другой хромосоме, то обе хромосомы ведут себя независимо. Такой частичный диплоид в отсутствие лактозы будет синтезировать ферменты lac-оперона с помощью мутантного оперона, а при индукции лактозой благодаря включению нормального lac-оперона будет производить и вторую порцию ферментов. Эти явления из-за ряда осложняющих обстоятельств, которые мы вскоре рассмотрим, не являются совершенно независимыми, но очень близки к таковым.

На основании рассмотренных данных Жакоб и Моно (Jacob, Monod, 1961) предложили изящную модель, которая хорошо объясняла эти данные, и сделали некоторые важные предсказания.

Суть их представлений можно понять из рис. 2.2. Прямая на этом рисунке изображает часть бактериальной хромосомы с локусами, обозначенными и х, у, z для трех структурных генов -галактозидазы, ацетилазы и пермеазы соответственно. Пунктирная линия — клеточная мембрана, а отрицательный знак в кружочке означает ингибирование или репрессию. Ген t, называемый теперь регуляторным геном, кодирует мРНК, с которой транслируется белок-репрессор. Этот белок диффундирует к локусу О — гену-оператору и, связываясь с ним, блокирует (репрессирует) транскрипцию мРНК на структурных генах .

Рис. 2.2. Схема -оперона, согласно представлению Жакоба и Моно (Jacob, Monod, 1961). Подробности см. в тексте.

Предполагается, что это происходит вследствие того, что он занимает участок инициации, с которого начинает работать РНК-полимераза. Лактоза инактивирует репрессор, соединяясь с ним по типу реакции связывания лиганда, рассмотренной в предыдущей главе; при этом изменяется трехмерная конфигурация репрессора, что делает его неспособным связываться с локусом О. Таким образом, согласно этой модели, индукция в действительности является дерепрессией — освобождением структурных генов от репрессии. Очевидно, нарушение в гене i, приводящее к образованию дефектного репрессора, который неспособен объединяться с О, даст конститутивный мутант, т. е. это дефект, который исправляется присутствием гена дикого типа в той же цитоплазме. Мутант О, с другой стороны, дает конститутивность, которая не может быть исправлена нормальным О-геном, что и объясняет эффект цис-положения.

Со времени появления этой модели регуляции убедительно показана адекватность ее основных свойств и добавлен ряд деталей, дополняющих картину. Так, удалось выделрть

постулированный белок-репрессор (Gilbert, Miiller-Hill, 1966), и его свойства оказались именно такими, как предсказывалось моделью. Было показано, что он является тетрамерным белком, состоящим из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых способна связывать одну молекулу индуктора. Пока не ясно, сама ли лактоза взаимодействует с этим репрессором при нормальном протекании процесса индукции или инактивирующей молекулой является один из ранних продуктов катаболизма лактозы, такой, как алло-лактоза. Если было бы верно последнее (а в пользу этого имеются некоторые данные; Burstein et al., 1965), то процесс индукции включил бы петлю положительной обратной связи: алло-лактоза, продукт -галактозидазной активности, инактивирует репрессор и таким образом приводит к увеличению выхода -галактозидазы. Но существует другая петля положительной обратной связи, которая привлекает наше внимание к интересной особенности этой модели. За транспорт лактозы в клетку ответственны два других фермента— -галактозидпермеаза и -галактозидацетилаза. Чем больше лактозы, тем больше ингибируется репрессор и тем больше будет выход транспортных ферментов. Такой процесс будет протекать с ускорением и остановится только тогда, когда весь репрессор инактивируется, а структурные гены будут работать на полную мощность, но гораздо более важным является вопрос о том, как этот процесс начинается. Некоторое количество транспортных ферментов должно быть в клеточной мембране просто затем, чтобы позволить лактозе войти внутрь клетки и начать индукцию. Как же запускается этот насос? Ответить на вопрос можно следующим образом: насос функционирует всегда, поскольку в системе управления существует утечка. Неиндуцированная популяция бактерий содержит в среднем 0,5 молекул -галактозидазы на клетку. Эта величина характеризует фоновый ферментативный синтез, обусловленный «шумом» механизма управления: комплекс репрессор — оператор изредка диссоциирует вследствие эффектов теплового шума, что приводит к кратковременному синтезу мРНК. Очевидно, несовершенство является важной особенностью конструкции клетки.

Модель, представленная на рис. 2.2, — это по существу выключатель, действующий по принципу положительной обратной связи, который включается в присутствии лактозы и выключается (с некоторым шумом) в ее отсутствие. При обсуждении ферментативной адаптации мы видели, что в присутствии глюкозы lас-оперон выключается и индукция лактозой начинается только после того, как глюкоза удаляется из среды. Как можно объяснить этот «эффект глюкозы»? Встроим простую схему рис. 2.2 в сложную систему клеточного метаболизма и рассмотрим

физиологическую роль, которую играет lac-оперон. Когда клетка снабжается глюкозой, то, выражаясь телеологически, lас-оперону нет необходимости функционировать. Он только добавил бы глюкозу к уже вполне обеспеченному ею гликолитическому пути, а производство ферментов lас-оперона только отвлекло бы нуклеотиды и аминокислоты на синтез ненужных молекул. Это подобно ситуации, описанной в предыдущей главе, когда клетки, обеспеченные конечным продуктом, например изолейцином, не нуждаются в выработке предшественников изолейцинового синтеза и соответствующим образом регулируют их производство из источника (через первый фермент метаболического пути, ведущего только к этому конечному продукту). Здесь налицо отрицательная обратная связь, и мы можем предположить, что аналогичный процесс имеет место и в управлении активностью lас-оперона, когда есть хороший источник углерода, например глюкоза. Проблема состоит в том, чтобы найти этот конечный продукт катаболизма углеводов. Эту роль могли бы играть многие продукты катаболизма, и множество их было исследовано в поисках неуловимого так называемого катаболитного репрессора (Prevost, Moses, 1967). Предполагалось, что такой репрессор управлял бы не только lас-опероном, но любой ферментативной системой, которая может поставлять молекулы в катаболический путь, общий для энергетического метаболизма и синтеза белков. На эту роль годятся многие расщепляющие ферменты, такие, как трипто-фаназа, некоторые дезаминазы, гистидаза, некоторые фосфори-лазы и т. д. Нам же нужна некая молекула, которая участвует в регуляции активности широкого спектра катаболических ферментов, управляя основным энергетическим потоком в клетке. Результаты последних лет решительно указывают на то, что молекулой, играющей эту роль и действующей как «сигнал глю-козного истощения» в клетке, является цАМФ (Makman, Sutherland, 1965; Crombrugghe, 1971; Pastan, Perlman, 1970). Однако влияние этой молекулы положительно — она индуцирует синтез катаболических ферментов, в то время как в ее отсутствие эти ферменты практически не синтезируются. Таким образом, необходимо рассмотреть управляющую систему, в которой высокий уровень глюкозы даст низкий уровень цАМФ, и наоборот; а кроме того, цАМФ обязательно должен быть индуктором lас-оперона.

Пример системы с такими свойствами представлен на рис. 2.3. Я изменил принятые на рис. 2.2 обозначения, чтобы привести их в соответствие с обозначениями, введенными в предыдущей главе для описания молекулярных управляющих процессов, используя кружки для представления точек управления (фактически существующих или потенциальных), а квадраты —

для обозначения метаболических пулов. Здесь G — гены или опероны, R — полисомы, репрессор, -галактозидаза, транспортные ферменты, а аденилатциклаза, катализирующая образование цАМФ из АТФ. -оперон представлен как отдельная единица эпигенетического управления. Лактоза поступает в клетку с помощью транспортных ферментов, локализованных в клеточной мембране, и затем выступает в роли инактиватора репрессора.

Рис. 2.3. Возможная схема управления для lас-оперона, включающая катаболитную репрессию.

Природа положительной обратной связи этой части управляющей цепи очевидна, так как двойное отрицание равносильно положительному утверждению, и поэтому транспортные ферменты обладают положительным действием. Продукты -галактозидазной реакции на рис. 2.3) включаются в гликолитический путь, приводя к образованию катаболитного репрессора (КР). В процессе гликолиза также синтезируется АТФ, который превращается аденилатциклазой в цАМФ. Принято считать, что катаболитный репрессор является ингибитором аденилатциклазы, как это предполагается в исследованиях Петерковского и Газдора (Peterkovsky, Gasdor, 1974). Циклический АМФ, по-видимому, необходим как сигнал для начала транскрипции lас-генов. Существуют данные, что он действительно играет эту роль на промоторе — участке lас-оперона, который ответствен за присоединение РНК-полимеразы к ДНК и инициацию транскрипции мРНК (Beck-worth, 1967). Этот участок расположен между генами i и О на рис. 2.2.

На рис. 2.3 представлены также фермент транспортирующий глюкозу, и включение глюкозы в гликолитический путь — пул . Отсюда ясно, почему клетки дикого типа не производят -галактозидазу (и транспортные ферменты) в присутствии глюкозы: в этом случае велик пул катаболитного репрессора и количества имеющегося цАМФ недостаточно для инициации транскрипции. Очевидно, что эта роль цАМФ должна быть специфичной для генов, кодирующих катаболические ферменты клетки, так как многие другие гены детерминируют мРНК в этих условиях. Ответ цАМФ на «глюкозное истощение» является примером сигнала управления, функционирующего на сравнительно высоком уровне физиологической регуляции, так как цАМФ управляет не просто одним опероном, как это делает лактоза, а целым классом оперонов, содействующих выполнению одной и той же физиологической функции — обеспечению энергией и производству блоков для анаболизма с помощью катаболических путей метаболизма. В основе такой регуляции лежит отрицательная обратная связь, но детали управляющих взаимодействий могут быть при этом довольно сложными. На рис. 2.3 представлен только один из множества возможных вариантов.