Локальная и глобальная упорядоченность: имагинальный диск и конечность таракана

В качестве примера развивающейся системы рассмотрим конечность насекомого. Эмбриологически она происходит из имагинального диска конечности, который образуется в поздней эмбриональной или ранней личиночной стадии в результате утолщения эпидермиса. У личинки имагинальные диски конечностей и других органов в результате деления клеток растут и инвагинируют, принимая у зрелой личинки характерную мешкообразную форму. В ходе метаморфоза складчатый эпителий диска разворачивается и клетки изменяют форму, дифференцируясь в компоненты взрослой структуры, в случае конечности — в сегментированный отросток.

Если взять вырезанный из личинки имагинальный диск, разрезать его на две части и кусочки приживить к брюшку взрослого насекомого, то один кусочек будет регенерировать так, что в ответ на индукцию дифференцировки при метаморфозе хозяина даст образование всех структур нормального отростка, в то время как другой после дифференцировки удвоится и даст зеркальное подобие самого себя. Подробные исследования этого свойства диска конечности, проведенные Шубигером (Schubi-ger, 1971), и диска крыла — Брайантом (Bryant, 1975а), выявили все типы поведения, которое можно ожидать от любого кусочка диска. Брайант (Bryant, 1971, 1975b) объяснял эти данные, исходя из представлений о существовании одномерного градиента способности к развитию, но, как отмечалось Френчем, Брайантом и Брайантом (French, Bryant, Bryant, 1976), при анализе структурной регуляции имагинального диска крыла Drosophila и конечностей таракана и амфибии этот подход не может объяснить некоторых результатов. Это ясно видно из анализа рис. 6.3. На нем изображен диск крыла Drosophila-, С — точка, которая, как установил Брайант (Bryant, 1975а), обладает в каком-то смысле максимальной способностью к дифференцировке, так как если диск разрезать на две части по любой прямой, скажем Ф, то кусочек, на котором находится точка С,

будет регенерировать, а другая часть — удваиваться. Однако если разрез сделать по кривой , то получившиеся два кусочка будут вести себя не так, как предсказывает модель: верхняя часть будет регенерировать, а нижняя, с точкой С, удваиваться. Формальная модель, объясняющая этот факт, предложена в статье Френча, Брайанта и Брайанта (French, Bryant, Bryant 1976). Авторы считают, что диск пространственно организован в соответствии с полярной системой координат; полюс ее находится в точке С, а остальные участки диска организованы по контуру в соответствии со значением угловой переменной, которая меняется вдоль этого контура от 1 до 12, как на циферблате. При этом принимается, что и, следовательно, разрыва значений этой переменной в начале координат не существует.

Рис. 6.3. Схематическое представление имагинального диска крыла Drosophila со значениями угловой координаты, введенными Френчем и др. (French et al., 1976) для объяснения результатов экспериментов по регенерации и удвоению.

Теперь легко выявить правила, управляющие поведением кусочков диска.

Где бы ни был сделан разрез, поверхности разреза соединяются вместе (в соответствии с экспериментальными данными) и вдоль линии объединения происходят клеточные деления. Новым клеткам будут соответствовать значения угловой переменной, равные средним арифметическим переменных их соседей, вычисленные по следующему правилу: эти значения равны недостающим значениям, замыкающим контур самым коротким из всех возможных путей. Таким образом, участки 2 и 10 кусочка, лежащего выше линии разреза (D на рис. 6.3, войдут в соприкосновение после соединения вдоль линии разреза, и между этими значениями будет происходить рост до тех пор, пока не будет восстановлен ряд значений угловой координаты — 11, 12/0, 1. Это, очевидно, приведет к удвоению. Другой кусочек будет регенерировать, так как самый короткий путь по контуру между значениями 10 и 2 на линии разреза есть 11, 12/0, 1, а не 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3. Таким образом, восстановится полный набор значений угловой переменной и образуется нормальная структура. Значения поля, которые принимают клетки, расположенные внутри области, усредняются по тому же правилу, как и в рассмотренном случае угловых переменных, только применительно к радиальным переменным. В результате всегда получается гладкая двумерная карта ткани, но

в случаях удвоения карта вырождается, так как две разные точки имеют одинаковые значения угловой координаты и зеркально симметричны относительно некоторой линии.

Если разрез сделан вдоль кривой , то, согласно установленным выше правилам, кусочек, лежащий выше разреза, регенерирует, а ниже — удвоится, что согласуется с экспериментом. Френч и Булльер (French, Вulliere, 1975а, b) показали, что эти правила определяют регенеративное поведение конечности таракана при самых разнообразных способах разрезания, при трансплантации и повороте трансплантата. Это чрезвычайно убедительный результат. Тем самым мы имеем простой и ясный метод, с помощью которого можно предсказать результат любой операции на конечности таракана, включающей простые хирургические манипуляции. Этому типу операций посвящено большое число работ в области эмбриологии, и очень интересно посмотреть, как широко можно пользоваться одной-единственной формальной моделью этого класса. Первый шаг в этом направлении — данные Френча и др. (French et al., 1976) о том, что правила, применимые к конечности таракана, применимы также к имагинальным дискам Drosophila. Однако нас сейчас интересует вопрос о том, какой морфогенетический процесс, генерирующий поле, может привести к периферической организации, характерной для полярной системы координат (рис. 6.3), и объяснить правила роста, усреднения и установления кратчайшего пути по контуру, которые так изящно описывают экспериментальные данные. Попытаемся решить этот интересный вопрос.

На рис. 6.4, А схематически представлен контур поперечного сечения развивающейся структуры, такой, как имагинальный диск, конечность таракана или конечность амфибии. Для облегчения сравнения со схемой Френча и др. (French et al., 1976) изображено двенадцать координатных позиций, но теперь каждой из них приписана пара значений поля , где индекс относится к значению координаты. Значения поля образуют градиент вдоль дорсо-вентральной оси, симметричный относительно передне-задней оси, в то время как значения образуют передне-задний градиент другого вещества или активности с дорсо-вентральной симметрией. Такая система двойного градиента находится в согласии с большинством классических работ, показывающих, что передне-задняя и дорсо-вентральная оси закладываются отдельно, в разные моменты развития конечностей. Такая же ситуация имеет место и в других тканях, например сетчатке, о чем речь пойдет позже. Трудность работы с такой схемой состоит в том, что насколько легко объяснить, как должны восстанавливаться недостающие значения (скажем,

между 1 и 5) с помощью процесса усреднения, который продолжается до тех пор, пока все отсутствующие значения не будут восстановлены, настолько же не ясно, каким образом регенерировать точку экстремума (1 или 7), если она удалена. Такие экстремумы подобны граничным значениям, и до сих пор нет ни одной модели, которая давала бы одновременно и рецепт восстановления граничных значений, и возникновение усредненных промежуточных значений поля.

Рис. 6.4. А Схематическое изображение поля угловых координат для конечности, где дорсо-вентральный градиент значений поля изображен числами, которые набраны курсивом по внешней стороне окружности, а передне-задний градиент —обычными числами внутри окружности Б. Равновесное поле, получающееся в результате применения правил генерации, описанных в тексте, к случаю приживления трансплантата правой конечности (внутренняя окружность) на культю левой (внешняя окружность); показаны позиции и ориентации лишних конечностей.

Однако совершенно ясно, что, пока мы не в состоянии объяснить эти два процесса, мы не можем считать, что построили модель, описывающую динамику поля развития. Сформулируем простые правила, которые дают такое поведение. Мы определили их в результате исследований, выполненных совместно с д-ром Каммингсом и д-ром Протеро. Полное рассмотрение этого обобщенного полевого подхода, дающего правила получения граничных значений и определения внутренних значений поля для целого ряда процессов, которые формируют структуры (включая регенерацию гидроидов, сомитогенез, образование структуры пера, филлотаксис и регенерацию

конечности), находится в процессе подготовки к публикации.

Рассмотрим вначале процесс интеркалярного роста, т. е. появление новой ткани, когда соединяются две отрезанные поверхности с разными значениями поля. Суть этого процесса на языке полевых чисел рис. 6.4, А состоит в том, что всякий раз, когда при разрыве поля наклон набора значений поля получается больше 1, начинается рост. (Наклон поля в координатной позиции n определяется как

подобное же соотношение имеет место и для g. Координаты пронумерованы от 1 до 12.) Значения поля присваиваются новой ткани в соответствии со следующими правилами (смысл их вскоре станет очевидным).

1. Если то новое значение поля в координатной позиции n равно

где С — константа, -среднее по пространству, т. е.

2. Если , то

где К — константа. Отсюда получается, что если то а если . Таким образом, значения поля постепенно расходятся до тех пор, пока не будет достигнут либо максимум (7), либо минимум (1). Аналогичные правила применяются и к другому параметру, g. Следовательно, наклон определяет, какое значение поля примет новая ткань — в соответствии с правилом дивергенции, дающим экстремум, или с правилом усреднения. Образно говоря, эти правила означают, что клеткам «нравится» находиться в морфогенетическом поле с наклоном 1, что ведет к уменьшению наклона, если он больше 1, и к увеличению, если он меньше. Число 4 в выражении (6.3) — постоянный параметр, заданный генетически.

Посмотрим, как эти правила объясняют результаты различных операций. Предположим, что значения поля старой ткани остаются неизменными. Пусть разрез, делящий структуру на две части, сделан между координатными позициями . Рассмотрим вначале меньшую часть; мы видим, что значения поля (2, 3 и 4,1) сведены вместе на поверхности раздела.

Наклоны при этом больше 1, поэтому для присвоения значений поля новой ткани используется усреднение (6.2). Приняв для удобства мы получим, что новые значения поля равны

Эти значения устойчивы, поэтому в результате операции меньшая часть удвоится, что и наблюдается в эксперименте.

В большей части ткани наложатся значения поля и (5, 2). Тогда произойдет рост, и новой ткани в позиции будут приписаны путем усреднения значения поля (3, 3). Наклон в f между новой и старой тканью все еще больше 1, поэтому происходит дальнейший рост и продолжается усреднение. Новые значения поля в позициях равны

При восстановлении это дает ряд 2, 3, 4, который устойчив. Значения другой переменной равны

Здесь образуется ряд 2,5; 3; 3,5, наклон которого меньше 1 в каждой позиции, поэтому необходимо воспользоваться моделью дивергенции (6.3). Приняв мы получим

Теперь это тоже устойчивый ряд, и в результате мы имеем восстановление недостающих значений большей части, что и требуется. На этом примере видно, как дивергентная модель дает экстремум (в данном случае минимум). Если бы при разрезе

удалился максимум, он был бы восстановлен с помощью того же правила.

Рассмотрим следующий тип эксперимента по трансплантации, который приводит к образованию лишних конечностей. Предсказав результаты этих опытов, мы получим веские доводы в пользу адекватности схемы, разработанной Френчем и др. Если регенерируемую почку конечности амфибии или таракана пересадить на место ампутированной конечности, расположенной с противоположной стороны, так что дорсо-вентральные оси при этом совместятся, а передне-задние окажутся противоположно направленными, то получится трансплантат, из которого разовьются две лишние конечности с той же самой передне-задней полярностью, что и у культи. Эта ситуация схематически показана на рис. 6.4,Б, где наружный круг изображает культю, а внутренний — трансплантат. Как было показано, применение правил образования значений поля дает числовые ряды, приводящие к требуемым результатам, так как предполагается, что, где бы ни возник законченный периферический ряд значений поля, в этом месте образуется новая конечность. Например, между координатной позицией культи 0 и позицией трансплантата (JQ) значения поля (5,6) и (5,2) соприкасаются друг с другом. Различие между 6 и 2 приводит к интеркалярному росту и задает значения поля новой ткани в соответствии с правилом усреднения, в результате чего образуется устойчивый ряд 6, 5, 4, 3, 2. Другая пара значений поля равна (5, 5) с наклоном, меньшим 1, поэтому используется правило дивергенции и получается ряд 5, 6, 7, 6, 5, дающий максимум. Это справедливо для всех рядов значений поля в верхней половине трансплантата, в то время как в нижней половине повсюду получается другое экстремальное значение, 1. В точках, где совмещены значения поля (4, 4), равновесие неустойчиво, поскольку новые значения поля равны старым:

однако любое сколь угодно малое возмущение этих значений в сторону увеличения приведет к дивергенции к 7, а в сторону уменьшения — к 1. Поскольку ткань выше горизонтали движется к 7, то естественно предположить, что это возмущает смежную область ткани и образуется ряд 4, 5, 6, 7, 6, 5, 4; ниже горизонтали происходит дивергенция в противоположном направлении, давая ряд 4, 3, 2, 1, 2, 3, 4. Так образуются периферические последовательности, дающие избыточное число конечностей.

Применяя эти правила к другим типам трансплантации, нужно помнить о возможности получения артефактов; это может

быть связано с грубостью числовых рядов и некорректным выбором параметров, таких, как С и К в выражениях (6.2) и (6.3), которые мы считали равными 1 просто для наглядности. В действительности значения поля, естественно, будут более непрерывными, т. е., оперируя числами от 1 до 70, мы получили бы гораздо более правдоподобный результат, чем с числами от 1 до 7; параметры же должны выбираться, исходя из экспериментальных данных.

Некоторые свойства схемы, описанной в общих чертах выше, стоит обсудить отдельно. Система двойного градиента представляется довольно очевидным способом упорядочения периферического поля и поэтому является общепризнанным решением проблемы. Однако, чтобы воспроизвести экспериментальные данные, необходимо ввести правила, с помощью которых образуются экстремальные значения поля. Они требуют физиологической интерпретации. Переключение с дивергентного на конвергентное (усредняющее) поведение в ответ на изменение наклона поля можно представить себе как мембранозависимый процесс, включающий фазовый переход между состояниями возбудимости и невозбудимости, такого типа, как рассмотренный в следующей главе, в связи с мембранной волновой моделью, приводящей к режиму генерации градиента или режиму усреднения соответственно. Неясна также природа процесса, измеряющего наклон поля, но вполне возможно, что прощупывание ближайших клеточных поверхностей с помощью филоподий приводит к появлению сил, действующих как переключатели. Хотя предложенные правила генерации никоим образом не единственны, кажется очевидным, что в организации периферического поля обязательно участвуют какие-то процессы переключения дивергенция/конвергенция, связанные с клеточной поверхностью. Понимание принципиальной основы поведения позволяет нам сосредоточиться на выяснении природы физиологических процессов на клеточном уровне.

Из этих примеров ясно, что необходимо проводить четкое различие между понятиями «значение координаты», обозначающим позицию в ткани согласно некоторой удобной схеме, и «значение поля», связанным с состоянием клетки или слоя клеток. Первое устанавливается по договоренности, а последнее изменяется согласно определенным правилам или динамическим ограничениям. Использование термина «позиционное значение» путает их и приводит к двусмысленности.

Интересно отметить, что усредняющее выражение (6.2) представляет собой дискретный вариант уравнения

стационарные решения которого есть решения уравнения Лапласа

где — значение поля в позиции х. Таким образом, мы, имея дело с полем, сталкиваемся с тем же типом поведения, что и в случае простого диффузионного процесса. Однако совсем не обязательно рассматривать лежащие в основе процесса механизмы как механизмы химической диффузии. При этом мы освобождаемся от ограничения, связанного с представлением полей развития в терминах схем, включающих химические превращения и диффузию, что приводит к значительному упрощению аналитического описания процессов, генерирующих поле. Диффузионно-химические системы продолжают оставаться полезными при детальном изучении отдельных процессов, но сложность и зависимость от произвольных параметров делают их неподходящими для построения общей теории развития. Дивергентная форма (6.3) расширяет классическое описание поля, рассматривая образование граничных или экстремальных значений. Таким образом, предложенная модель приводит к крайне простому и обладающему описательной силой обобщению теории поля.