Полярность и осевые градиенты

В основе модели эпидермального гомеостаза лежит представление о наличии градиента вещества вдоль оси организации, которая перпендикулярна базальной мембране (рис. 5.1). Таким образом, можно сказать, что ткань поляризована в направлении этой оси пространственной организации: проксимальные клетки, примыкающие к базальной мембране, находятся в другом состоянии, чем дистальные (у поверхности эпидермиса), все остальные клетки плавно распределены по состояниям, промежуточным между этими двумя. Говоря более абстрактно, образование полярной оси обусловлено существованием исходной точки или поверхности, определяющей начало и направление, в котором вдоль этой оси ведется измерение. Что именно измеряется и как эта информация воздействует на состояние клеток — вопрос, который для большинства развивающихся систем составляет главный предмет исследования. Но полярность в том или ином виде — почти универсальное свойство и многоклеточных, и одноклеточных организмов. Я рассмотрю природу этой упорядоченности лишь у некоторых примитивных многоклеточных; они широко используются в качестве объекта для исследования, потому что их организация в принципе одномерна, несмотря на то, что необходимые основания существования у них полярной устойчивости остаются предметом постоянного изучения. Итак, рассмотрим гидроиды Hydra и Tubularia. Hydra имеет крайне простую структуру; это в своей основе трубка с устьем (гипостомом), окруженным кольцом щупалец на дистальном конце, и с прикрепляющейся подошвой (базальным диском) на другом. Ее тканевая структура также очень проста и состоит из двух эпителиальных пластов, известных как эктодерма (внешний) и гастродерма (внутренний), прикрепленных к мезоглее, тонкому мембранному слою, содержащему коллагеноподобный материал. Размеры этого организма — от 1 до 2 см в длину (в зависимости от вида) и около 1 мм в диаметре, когда животное вытянуто. Фотография Hydra littoralis показана на рис. 5.2.

Эти организмы обладают поразительной способностью к регенерации целого из маленьких частей и восстановлению из отдельных фрагментов. Если отрезать сегмент центрального участка тела, то новая голова (гипостом и щупальцы)

регенерирует дистально, а новая подошва — проксимально, и первоначальная полярность ткани сохраняется. Эту полярность можно изменить на обратную различными воздействиями, например с помощью электрического поля [как показано Ландом (Lund, 1921) на Obelia и Роузом (Rose, 1963) на Tubularia] или пересаживанием гипостома на проксимальный конец и последующим удалением его через несколько дней (Wilby, Webster, 1970).

Рис. 5.2. Фотография Hydra littoralis, на которой видны ножка и гипостом, желудочная область, зона почкования с одной растущей почкой и одной дифференцированной гидрой, готовой отделиться от родительского организма, а также базальный диск (с любезного разрешения д-ра А. Хорнбрух).

Однако если сегмент очень короткий, то головы могут образоваться на обоих концах, т. е. полярность может быть обратимой; таким образом, существуют условия, при которых первоначальная осевая упорядоченность у Tubularia и Obelia теряет устойчивость.

Большое число ранних исследований метаболического происхождения полярности у гидроидов было выполнено С. Чайлдом,

который развил концепцию метаболических градиентов, в частности окислительного метаболизма, как основной причины осевой упорядоченности. Его исследования с ингибиторами и красителями наводили на мысль, что метаболическая активность наиболее велика в гипостоме и уменьшается по направлению к базальному диску. Теория метаболических градиентов, тщательно разработанная Чайлдом (Child, 1941), крайне плодотворна как руководство при исследовании и построении теорий, несмотря на противоречивые данные о существовании градиента окислительного метаболизма. Идеи Чайлда о роли диффузионных градиентов (для которых нужны метаболические градиенты того или иного типа), электрических полей и внутриклеточного сообщения в общем виде остаются основой многих представлений о динамической природе полярной упорядоченности в развивающихся системах. Ясный обзор развития этой области дан Вебстером (Webster, 1971).

Поскольку первой из участков средней части желудка гидроидов всегда регенерирует именно голова, а другие части дифференцируются позже, то, по-видимому, наиболее дистальная часть действует как организатор остальной системы и поэтому определяет начало полярной оси. В широком диапазоне размеров регенерирующего участка приблизительные размеры частей выросшего организма — гипостом, щупальцы, пищеварительная зона и подошва — остаются постоянными, т. е. организм способен не только регенерировать свои части, но и соизмерять их. Однако когда регенерирующие участки очень малы, это свойство масштабирования у Tubularia, и Corymorpha нарушается — головные части оказываются значительно больше других. Общая стратегия регенерации состоит в том, чтобы сначала вырастить функциональную голову, а затем образовать из оставшейся ткани другие части, привлекая в той или иной степени взаимодействия, приводящие к масштабированию или регуляции. Таким образом, гипостом в соответствии с постулатом Чайлда действует как доминирующая или организующая область. Далее встает вопрос о природе организующей активности. Некоторые исследователи предполагают, что существует гипостомный индуктор, производимый дистально, и что его градиент определяет область образования головы. Имеются некоторые данные в пользу существования такого вещества, являющегося, по мнению ряда исследователей, полипептидом (Lentz, 1965; Schaller, 1973). Можно было бы предположить, что оно действует в какой-то степени аналогично кейлону при индукции клеточной дифференцировки в эпидермисе, однако устойчивость осевой упорядоченности в эпидермисе зависит от двух других факторов: существования локализованной зоны роста в базаль ном слое и стока кейлона через базальную мембрану. Для

Hydra нет данных ни о наличии локальной зоны роста (Campbell, 1967), ни о том, что базальный диск действует как сток для гипостомного индуктора. Однако ясно, что гипостом и подошва во многих отношениях антагонистичны, так как пересадка подошвы в дистальную часть регенерирующего сегмента препятствует регенерации гипостома в этом месте и вызывает изменение полярности. Это может быть обусловлено или тем, что подошва действует как сток (т. е. разрушает гипостомный индуктор), или тем, что она производит антагонист — инактиватор или ингибитор гипостомного индуктора, или, наконец, тем, что в ней образуется собственный индуктор. Последнее доказано Ньюманом (Newman, 1974); им же рассмотрены все альтернативные возможности. Остановимся теперь на различных подходах к решению вопроса о природе осевой упорядоченности такого типа.

До последнего времени развитие аналитических моделей в этой области находилось под сильным влиянием идей и экспериментальных данных Волперта и его группы, которая работала главным образом с Hydra и цыпленком. Общий анализ проблем образования структур и морфогенеза развивающихся систем и выявление понятий, необходимых для решения этих вопросов, был сделан Волпертом (Wolpert, 1969). Основой этого анализа были концепция позиционной информации и интересный постулат, состоящий в том, что, какими бы ни были физиологические процессы, которые участвуют в генерации пространственно распределенной информации (например, градиента особого вещества), они универсальны для всего животного, а возможно, и растительного царства. Волперт утверждает, что в регулирующихся системах, таких, как морской еж или эмбрион амфибии, для установления оси, вдоль которой клетки дифференцируются в соответствии со своим местоположением, требуется: 1) исходная точка, с которой начинается отсчет; 2) направление для измерения вдоль этой оси и 3) механизм регулирования масштаба, который может менять единицы измерения вдоль оси так, что общее число единиц остается инвариантным при изменениях длины оси. По терминологии Волперта, это: 1) исходная клетка или область, полярность, служащая направлением, в котором измеряется позиционная информация, и 3) вторая контрольная клетка или область, обозначенная на противоположном от конце оси. Предполагается, что значения градиента в устанавливаются некоторым способом, не зависящим от длины оси, так что получается регулирующий градиент. При наличии такой оси клетки будут иметь информацию, специфичную для их местоположения на ней, и смогут дифференцироваться согласно некоторому «коду», интерпретирующему позиционную информацию,

Различие между позиционной информацией и ее интерпретацией оказывается очень важным моментом в анализе Волперта, и именно благодаря этому предположение об универсальности представляется возможным. Согласно его теории, разные виды могут использовать разные коды для интерпретации позиционной информации, задаваемой осями, которые одинаковы или подобны у всех видов организмов, достигая таким путем разнообразия фенотипов при сохранении основного эпигенетического механизма. Однако нельзя слишком уповать на процесс интерпретации, поскольку это означало бы просто перенесение проблемы из одной области в другую. Волперт оказывается в опасной близости от такой ситуации, утверждая что концепция позиционной информации позволяет обходиться без предположения о существовании какой-нибудь обязательной связи между структурой или предструктурой морфогенетического поля и пространственной упорядоченностью, которая становится очевидной, когда поле выражено (Wolpert, 1972). Так, он убежден, что один и тот же (линейный) градиент в одном организме может производить структуру, такую, скажем, как французский флаг, а в другом — как звездно-полосатый флаг США. Это очень экономично в плане механизмов позиционной информации, но, как мне кажется, обошлось бы крайне дорого при построении механизма интерпретации. С точки зрения Уоддингтона (Waddington, 1972) поиски универсальности морфогенетических механизмов являются, вероятно, иллюзорными и в развивающихся организмах работает ряд отчетливо различающихся процессов. Как будет видно из этой или двух последующих глав, я, как и Волперт, придерживаюсь в основном универсалистской точки зрения, но мне представляется, что организм работает скорее как аналоговая, чем как цифровая вычислительная машина, и, следовательно, я не разделяю его убежденности в способности развивающихся систем интерпретировать монотонный градиент как мозаичную периодическую структуру, структуру с круговой симметрией или любой другой формой, когда единственное ограничение — это ограничение, накладываемое на информационную размерность поля и результирующей структуры.

Волпертовский анализ образования структуры был умышленно представлен в абстрактных терминах, чтобы не связывать себя с той или иной моделью и невольно не попасть под ее влияние. Именно эта нейтральность и общность представлений стимулировали построение моделей, удовлетворяющих основным описанным требованиям, и экспериментальную проверку вытекающих из них следствий. Позже в данной главе я рассмотрю модель образования морфогенетического поля, которая свободна от последнего требования Волперта, поскольку регуляция в ней осуществляется без участия как механизма,

контролирующего масштаб, так и второй контрольной точки в системе, упрощая таким образом основную аксиоматику, необходимую для формирования поля позиционной информации. Ценой, уплаченной за это упрощение, оказывается то, что если ось меньше некоторой критической длины, то регуляция вдоль нее не происходит полностью. Однако именно это и наблюдается в таких организмах, как Tubularia и Corymorpha, поэтому кажется, что условие (3) лежит за пределами требований, вытекающих из экспериментальных данных. Новые исследования лаборатории Волперта по развитию конечности цыпленка привели к модели, совершенно отличной от той, которая была построена при изучении регенерации у Hydra. Эта модель несколько более динамична, чем использованная при описании феноменологии Hydra, она включает процесс роста и механизм временной дифференцировки, но концепция позиционной информации сохраняется за счет некоторой неопределенности интерпретации. В следующей главе мы рассмотрим эту модель, а также альтернативную ей, которая описывает с единых позиций оба типа процессов.

На данном этапе полезно рассмотреть математическую теорию, представленную Гирером и Мейнартом (Gierer, Meinhardt, 1972), которая описывает свойства довольно широкого класса процессов, соответствующих, как правило, поведению аксиально-упорядоченных систем. Эти авторы предполагают, что в таких системах протекают два различных процесса, взаимодействие между которыми приводит к плавному распределению клеток по состояниям. Один из них способен активировать небольшую область, что характерно для индукции, когда положительное влияние передается от одной клетки или группы клеток ее соседям, и вклад в индуцирование структуры дают лишь соседние ткани. Так происходит, например, когда субгипостомная ткань трансплантируется в среднежелудочковую область Hydra и здесь индуцируется гипостом. Это влияние близкодействующее, потому что затрагиваются только соседние с трансплантатом клетки. Вторым процессом, по их предположению, является ингибирование большой области, что выявляется, например, подавлением образования гипостома в дистальном положении в присутствии гипостома, трансплантированного проксимально, причем ингибитор действует на расстоянии в несколько сот клеток. Предполагается, что различия между этими типами действия обусловлены разными скоростями диффузии специфических веществ, активатора и ингибитора, хотя не исключаются и другие пути возникновения близко- и дальнодействующих взаимодействий (см. далее). Гирер и Мейнарт предполагают также, что для этих веществ существует плавное распределение плотностей источников и (пли) стоков, что дает начало полярности

ткани. Кроме того, как считают авторы, плотности источников и стоков отличаются от распределения концентраций самих веществ и управляются процессами, которые характеризуются большими временами релаксации, чем для активатора и ингибитора, в соответствии с данными, полученными на гидроидах. Таким образом, модель применима к событиям, происходящим в пределах нескольких (скажем, от 4 до 12) часов после любого экспериментального возмущения; это время необходимо для того, чтобы установить начальный градиент. Такие постулаты приводят к следующим дифференциальным уравнениям:

где - координата вдоль оси. В этой системе а — активатор; h — ингибитор; -распределение источников активатора, — то же для ингибитора; члены описывают влияние а и h на соответствующие скорости их синтеза; и v — константы распада первого порядка, a - коэффициенты диффузии, причем предполагается, что Вид функций зависит от предположений, сделанных о кинетике рассматриваемого процесса (например, взаимодействие конкурентного или неконкурентного типа между а и , и стехиометрии реакций. В общем случае это нелинейные функции, описывающие активность ферментов с кооперативной кинетикой и аллостерическими свойствами (гл. 1). Именно присутствие этих функций в системе уравнений (5.1) придает ей свойства, необходимые для образования устойчивых градиентов из соответствующих начальных условий, наложенных на функции . Эта система уравнений принадлежит к общей категории уравнений, описывающих реакционные системы с диффузией, причем первым примером их использования для описания морфогенеза является теперь уже классическая работа А. Тьюринга (Turing, 1952), показавшего возможность генерации периодических волн концентрации морфогена в ткани. Мейнарт и Гирер (Meinhardt, Gierer, 1974) применили свою модель к описанию Hydra и других развивающихся систем и показали, что она удовлетворяет многим требуемым свойствам. Вопросы о связи между концентрациями активатора и ингибитора, действующими как морфогены, и о их действии на дифференцировку клеток при этом подходе, конечно, не рассматриваются, а критерием для различения двух процессов являются их времена релаксации. Как отмечают авторы, совпадение с экспериментом не позволяет сделать никаких выводов об адекватности модели. Данные, необходимые для выяснения деталей рассматриваемых

молекулярных механизмов, могут дать только биохимические и физиологические исследования. Однако данная модель представляет определенную ценность, поскольку показывает, что общей схеме соответствует целый ряд механизмов различного типа, что обеспечивает основу для классификации довольно разнообразного набора моделей. Они применяются не только к описанию гидроидов и плоских червей, но и к любой развивающейся системе с аксиальной структурой и полярной упорядоченностью.

Главным недостатком этой модели представляется то, что она не объясняет регуляции, так как при изменении линейных размеров системы мы получаем градиент, который имеет другую позиционную информацию в пределах новой длины. Это показано в первой статье Гирера и Мейнарта (Gierer, Meinhardt, 1972). Перед тем как искать модель, обладающую таким свойством, обратимся к организму, развитие которого нельзя объяснить на основании статических градиентов типа рассматривавшихся до сих пор при описании механизмов, упорядочивающих пространство. Это приведет нас к рассмотрению способа образования градиента, довольно сильно отличающегося от всех рассмотренных ранее.