Представление клеточного цикла в виде последовательности стадий

Митотический цикл удобно рассматривать как упорядоченную во времени последовательность физиологических событий, которые в совокупности составляют полный набор процессов, происходящих между двумя митозами. Мы видели, что в бактериях существует четко выраженная упорядоченная связь между репликацией хромосомы и ростом перегородки, которая физически разделяет две дочерние хромосомы, заключая их в разные клетки. Такое временное упорядочивание необходимо для выполнения структурных требований: например, прежде чем хромосомы будут разделены между дочерними клетками, они должны дуплицироваться. Именно существование структурных ограничений такого типа делает необходимым появление в клетках упорядочивающих во времени процессов, периодические сигналы которых обусловлены метаболическими колебаниями того или иного рода. Как мы видели, у прокариотов последовательные циклы хромосомной репликации могут перекрываться во времени — вторая инициация происходит до того, как завершается первая репликация хромосомы. Никакие структурные ограничения таким перекрыванием не нарушаются. Однако у эукариотов фаза дупликации хромосом всегда выделена во времени, так что за один цикл происходит только одно удвоение (за исключением особых случаев, приводящих к полиплоидии, при которой осуществляется последовательная дупликация хромосом без деления клетки). Это позволяет представить цикл так, как показано на рис. 3.4. Наиболее просто физиологически идентифицируемыми частями цикла являются М — фаза митоза и S — фаза репликации ДНК. Эти фазы, или стадии, разделены другими периодами, обозначаемыми в течение этих периодов происходят события, о которых до сих пор мало что известно (отсюда и их обозначение G — от слова «gap» — промежуток). Фаза по своей продолжительности сильно колеблется даже в пределах одного типа клеток (например, эпидермальные клетки мыши); длительность фаз S и обычно задана более точно и равна нескольким часам каждая, хотя существуют и исключения (например, у гидры меняется

длительность именно фазы G2; David, Campbell, 1972). Фаза митоза или деления ядра короче других, и за ней обычно следует цитокинез — не показанное на схеме деление клетки на две.

Рис. 3.4. Фазы клеточного цикла эукариотов.

Задача, стоящая перед экспериментатором, изучающим клеточный цикл эукариотов, состоит в том, чтобы выявить связь между событиями, происходящими на различных стадиях, и затем, если это соответствует его мировоззрению и философии, построить причинную модель для объяснения переходов клетки от одной стадии к другой. Стадии — это, конечно, разные состояния клетки, заданные в виде концентраций различных веществ, физических связей между ними и скоростей различных процессов, происходящих одновременно. Предел, до которого каждую стадию можно подразделять далее на составные части или подстадии, зависит от количества информации о протекающих процессах. Пока такой информации для подразделения фаз недостаточно.

Saccharomyces cerevisiae

Очень важные данные об организации клеточного цикла эукариотов дали интересные генетические исследования дрожжей, проведенные Хартвеллом и др. (Hartwell et al., 1974). Они выделяли термочувствительные мутанты, которые при 23 °С росли нормально, а при 36 °С прекращали рост в некоторой определенной точке цикла. Мутанты были классифицированы в соответствии с этапами клеточного цикла, которые они могли пройти, и тогда начала вырисовываться картина причинных связей между наблюдаемыми процессами — инициацией репликации ДНК, синтезом ДНК, появлением почки, миграцией ядер, цитокинезом и т.д. Оказалось, что у дрожжей существуют две причинные последовательности: одна, связанная с внутриядерными событиями, такими, как инициация репликации ДНК, синтез ДНК и деление ядер, и другая, включающая появление почки, миграцию ядер, цитокинез и клеточное деление. В обычных условиях они связаны вместе в начале общим «стартовым» событием, а в конце — цитокинезом и клеточным делением. Однако имеются мутанты, в которых эти процессы разобщены, в результате чего, например, последовательные циклы ядерных явлений могут происходить без образования почек и цитокинеза и, наоборот, последовательные циклы образования почки могут совершаться с нормальной частотой без какой-либо корреляции

с событиями в ядре. Это совершенно аналогично разобщению хромосомных и цитоплазматических явлений, которые могут иметь место в бактериях, где последовательные циклы репликации ДНК возможны в отсутствие процессов образования перегородки и деления клетки точно так же, как последовательные циклы роста и деления у некоторых термочувствительных мутантов совершаются в отсутствие синтеза ДНК. Таким образом, мы приходим к выводу, что либо каждой периодической последовательностью управляют разные осцилляторы или часы, в норме сопряженные, либо обе они приводятся в действие одним особым осциллятором, который в этом случае должен управлять «стартовым» событием.

Physarum polycephalum

При изучении причинных связей, определяющих митотический цикл, очень полезным оказался миксомицет Physarum polycephalum. Во время вегетативной фазы этот организм представляет собой синцитий, непрерывную массу цитоплазмы, которая по своим размерам может достигать нескольких сантиметров и содержать миллионы ядер. В лабораторных условиях грибок обычно выращивают на кружках фильтровальной бумаги диаметром 2—3 см, насыщаемой снизу питательной средой. Особенностью этого организма, которая делает его замечательным объектом для биохимических исследований митотического цикла, оказывается непрерывность цитоплазмы, что приводит к высокой степени синхронности митозов во всех ядрах. Таким образом, мы по существу имеем дело с системой, которая ведет себя как одна очень большая клетка. Большие размеры, конечно, удобны для биохимического анализа. Исчерпывающий обзор поведения этого организма и схемы биохимических явлений, характеризующих его митотический цикл, можно найти у Раша (Rusch, 1970). Нам же для построения моделей митотического цикла нужны лишь некоторые данные о необходимых условиях, определяющих ряд зависимостей между событиями, которые происходят на различных стадиях цикла рис. 3.4.

Культуры плазмодия Physarum инициируют, нанося пипеткой аликвоту микроплазмодиев на фильтровальную бумагу, где они сливаются и образуют большую синцитиальную массу. Микроплазмодий Physarum — это грибок, растущий в условиях погруженной культуры во встряхиваемых флаконах; непрерывное перемешивание предотвращает слияние отдельных клеток. В пределах каждого микроплазмодия митозы синхронны, но между разными плазмодиями синхронность отсутствует, пока отсутствует связь. Поэтому слившиеся микроплазмодии первоначально рассинхронизированы, но приблизительно через 10 ч

после соединения наблюдается 99%-ная синхронность митозов на протяжении всего синцития. Сильная вариабельность длительности фазы у эукариотов подчеркивается тем фактом, что у Physarum этой фазы не существует вообще; синтез ДНК начинается непосредственно после телофазы, последней стадии фазы М, и продолжается около 3 ч. За этим следует фаза длительностью от 5 до 7 ч при 26 °С, когда миксомицет выращивается на обедненной среде. Митоз продолжается около 20 мин, поэтому полное время цикла — от 8 до 10 ч.

Является ли репликация ДНК необходимым условием митоза у Physarum? На этот вопрос можно получить довольно четкий ответ. Когда происходит слияние маленького плазмодия, находящегося в S-фазе, с большим плазмодием, как раз готовым вступить в митоз, то митоза ядра маленького плазмодия все равно не происходит. Значит, для того чтобы начался митоз, репликация хромосом должна быть завершена. Это предположение подтверждается тем фактом, что задержка репликации ДНК с помощью -фтордезоксиуридина задерживает митоз на одно и то же время. Снятие ингибирования приводит к митозу спустя приблизительно 6 ч, показывая, что шестичасовая фаза — также необходимый этап подготовки к митозу. Однако ядра, которые завершили синтез ДНК, могут немедленно вступить в митоз, если их перенести в плазмодии, находящиеся в конце периода следовательно, в фазе идет главным образом подготовка цитоплазмы к митозу. Эту стадию подготовки к митозу можно подавить вплоть до 20 мин перед митозом тепловым шоком (30 мин при 38 °С), который вызывает задержку, пропорциональную времени пребывания плазмодия в периоде Менее чем за 20 мин до митоза тепловой шок приводит к абортивному митозу из-за разрушения митотических веретен; хромосомы при этом не разделяются и ядра входят снова в S-фазу и становятся после псевдомитоза тетраплоидными.

Культуры, инициированные в разное время и поэтому в разные фазы митотического цикла, можно заставить соединиться друг с другом, что позволяет поставить эксперименты по слиянию так, чтобы можно было найти основные соотношения между различными стадиями цикла. Если принять гипотезу, аналогичную гипотезе инициатора в управлении репликацией ДНК, то можно предположить, что слияние плазмодия в S-фазе с плазмодием в Сг-фазе приведет к преждевременному началу репликации ДНК в ядрах последней. Однако этого не происходит— факт, который противоречит данным, полученным на Amoeba proteus (Prescott, Coldstein, 1967), и опытам по слиянию -клеток и куриных эритроцитов (Harris, 1967). Если принять гипотезу инициации репрессорного типа, то можно предположить, что если ядра в S-фазе перенести в плазмодий

в фазе то ядра приостановят репликацию ДНК, так как они теперь будут находиться при сверхпороговой концентрации репрессора. Это предположение также не подтвердилось: ядра в фазе S продолжали включать -тимидин в цитоплазме с фазой Однако при ближайшем рассмотрении оказывается, что эти результаты не являются неожиданными. Если в Physarum имеется белок-инициатор, вскоре после синтеза он израсходуется или разрушится, так что грибки в S-фазе не обязательно будут иметь дополнительный инициатор после самых ранних стадий репликации ДНК. Аналогично репрессоры инициации будут эффективно ингибировать только процессы, связанные с самым началом S-фазы. Как только хромосомы начали репликацию, они вполне могут вести тебя автономно. Действительно, твердо доказано, что имеется высокоупорядоченная последовательность событий, управляющая репликацией каждой отдельной хромосомы эукариотического ядра, — различные части хромосомы реплицируются в определенной последовательности. Эти хромосомы, конечно, намного сложнее, чем бактериальная хромосома, состоящая из множества (около 103) отдельных реплицирующихся единиц или «репликонов», каждый из которых, вероятно, синтезируется как единое целое. Единицы в пределах одной эукариотической хромосомы начинают свою репликацию в определенной последовательности, и, возможно, это происходит автономно, как только получен первый сигнал для репликации хромосомы. Этот первый сигнал в целом плазмодии может быть очень коротким и является следствием либо того, что концентрация инициатора выросла выше порогового значения, либо того, что концентрация репрессора упала ниже порога. Чтобы сделать выбор между этими двумя возможностями, требуются тщательные эксперименты по выбору времени слияния. Такие эксперименты недавно были поставлены Заксенмайером, Реми и Плэттнер-Скоубелом (Sachsenmaier, Remy, Plattner-Schobel, 1972), а также Кауфманом и Вилле (Kauffman, Wille, 1975), что позволило получить важные данные о природе системы управления митозом в этом организме.

Заксенмайер и др. использовали плазмодии, фазовый сдвиг между которыми всегда составлял 6 ч (половину -часового цикла этих культур), и соединяли их в различные фазы цикла. Они обнаружили, что если в одном плазмодии, скажем А, прошло от 0 до 6 ч после митоза, а во втором, В, от 6 до 12, то слияние всегда приводит к задержке развития В и ускорению развития А. Величина задержки всегда приблизительно одна и та же, около 30 ч, что составляет половину разности фаз между культурами. Если, с другой стороны, в плазмодии А прошло от 6 до 12 ч после митоза, а в В — от 0 до 6 ч, то результатом слияния являются задержка развития А и ускорение развития В,

как и ожидалось, так как состояния А и В просто поменялись местами. Из этих данных Заксеимайер и др. сделали вывод, что митоз управляется диффундирующим веществом, концентрация которого меняется пилообразно, т. е. так, как ведет себя концентрация репрессора инициации в предложенной Притчардом и др. модели управления инициацией синтеза ДНК у бактерий. Однако Заксенмайер и его коллеги предположили, что вещество, контролирующее митоз в Physarum, — это митоген, концентрация которого достигает своего максимума при митозе, а затем быстро падает до минимума за счет расходования или разрушения во время митоза. Таким образом, эта гипотеза предполагает положительное управление митозом, т. е. она аналогична теории инициатора в управлении репликацией ДНК. Соображения, на которых строится это утверждение, вытекают из более ранних работ Брюера и Раша (Brewer, Rusch, 1968), в которых было показано, что 30-минутные тепловые шоки (38 °С) в культурах Physarum, растущих при 26°С, вызывали задержки во времени достижения митозов, и эти задержки росли от 15 мин при шоке за 6 ч до митоза до 2 ч при шоке за 2 ч до митоза. Затем задержка резко уменьшалась. На основании этих данных было высказано предположение, что термолабильное вещество, по-видимому белок, накапливается в Physarum, когда гриб готовится к митозу, и затем используется при митозе; отсюда и был сделан вывод о существовании митогена.

Ни гипотеза митогена, ни гипотеза пилообразных релаксационных колебаний не следует с необходимостью из этих данных. Действие теплового шока можно объяснить, например, инактивацией фермента, разрушающего малую молекулу, действующую как корепрессор в регуляции митоза. В этом отношении было бы интересно поставить опыты по синхронизации на грибках, разделенных фильтрами с определенными размерами пор, для того, чтобы получить некоторое представление о молекулярном весе вещества — сигнала связи.

Постулат о пилообразной (релаксационной) форме колебаний осциллятора основывается на том, что имеется скачок от задержки по фазе к опережению по фазе, который происходит при переходе через митоз, как описано выше. Однако можно предположить, что такой разрыв возникает при слиянии систем с любым периодическим сигналом управления только в силу свойств предельного цикла. Этот вывод следует из элегантного качественного исследования колебаний, имеющих характер предельного цикла, выполненного Винфри (Winfree, 1970, 1971) при работе с биологическими часами (см. гл. 4). Кауфман и Вилле (Kauffman, Wille, 1975) использовали этот анализ для разработки экспериментального метода идентификации некоторых основных характеристик митотического осциллятора Physarum.

И хотя основные принципы этого анализа будут рассмотрены позже (при обсуждении работы Винфри о часах у Drosophila, контролирующих вылупление личинок), применительно к Physarum стоит остановиться на данном вопросе именно здесь, так как использующиеся при этом представления все еще относительно непривычны в биологии, а я думаю, что они имеют наиболее важное значение в изучении периодических процессов.

Рис. 3.5. Предельный цикл с наматывающимися траекториями, предложенный Кауфманом и Внлле (Kauffman, Wille, 1975) для объяснения регуляции митотического цикла у Physarum policephalum, и предсказание результатов экспериментов по слиянию.

Согласно гл. 1, устойчивый предельный цикл — это замкнутая кривая, которая является асимптотическим пределом траекторий процесса, развивающегося во времени. Пример двумерного предельного цикла показан на рис. 3.5, где приведены траектории, разматывающиеся к замкнутой кривой, С, из неустойчивой особой точки S, и траектории, наматывающиеся на цикл снаружи. Применяя эту картину к митотическому циклу Physarum, мы идентифицируем X и Y как два основных вида молекул, включенных в колебания, управляющие инициацией митоза; одной из этих молекул может быть митоген. У нас есть две переменные, потому что минимальное число, которое может породить предельный цикл, равно 2. Даже колебательный

процесс, представленный на рис. 3.2, фактически есть предельный цикл, так как для описания процесса использованы две переменные — концентрации мРНК и репрессора. Если построить график зависимости одной из них от другой, то мы получим картину, напоминающую представленную на рис. 3.6. Тот факт, что мРНК, как предполагается, синтезируется очень коротким импульсом и затем распадается, означает, что части цикла, отмеченные словом «быстро», проходятся очень быстро, в то время как другая часть цикла представляет собой медленное разбавление репрессора в результате роста клетки. Рассмотрим, как можно было бы представить слияние грибков разного относительного возраста в соответствии с рис. 3.5.

Рис. 3.6. Предельный цикл, управляющий клеточным циклом бактерий, в модели Притчарда и др. (Pritchard et al., 1963). Здесь репрессора инициации (Н);

Пусть точка А представляет собой состояние осциллятора, управляющего митозом, в данный момент до начала митоза. Если плазмодий в таком состоянии сольется с плазмодием, представленным точкой В], расположенной ближе к митозу (точка М на кривой), то их цитоплазмы объединятся и система окажется в некотором промежуточном состоянии между А и представленном точкой на хорде Это, конечно, только качественное геометрическое представление. Слившиеся грибки затем будут двигаться по траектории, которая проходит через вернутся на предельный цикл в некоторой точке, промежуточной между точками, представляющими состояния первоначальных грибков А и если предельный цикл у них остался ненарушенным. Таким образом, если промежуток между А и В равен 3 ч и опережает А, то можно ожидать, что слившаяся пара вступит в митоз часа через полтора после момента времени, ожидаемого

для в предположении, что находится на равном расстоянии от А и

Допустим теперь, что А фиксировано, так что один плазмодий всегда в момент слияния находится в одном и том же состоянии, а состояние другого изменяется и представляется точками . Тогда для предсказания результата слияния можно использовать один и тот же подход. Вскоре после слияния плазмодии окажутся в состояниях Из плазмодий вернется на предельный цикл по траектории, проходящей через и это приведет ее к точке, расположенной между предполагаемыми состояниями плазмодиев А и Это опять дает запаздывание для и опережение по фазе для А. Однако в случае состояний А и дающих при слиянии возвращение на предельный цикл происходит в точке между А и лежащей на противоположной стороне от особой точки S. В этом случае можно сказать, что митоз плазмодия А задерживается, а ускоряется; то же верно и для А и . Разрыв, таким образом, обусловлен существованием особенности S, неустойчивого фокуса внутри предельного цикла. Зная точные координаты точки, в которой происходит разрыв, можно сделать некоторые выводы относительно формы предельного цикла и расположения S, так как координаты показывают, насколько симметрично расположен цикл относительно фокуса. Этим методом можно оценить время, затрачиваемое на прохождение различных частей цикла. Кауфман и Вилле (Kauffman, Wilie, 1975) назвали рассмотренное явление разрывом дуги и с его помощью нашли форму постулированных колебаний, управляющих митозом у Physarum (см. также Kauffman, 1974). Затем они использовали этот анализ для того, чтобы предсказать действие теплового шока различной длительности в отдельные фазы цикла, и получили хорошее соответствие со своей моделью. Им также удалось показать, что осциллятор сам не является частью митотического процесса, так как нарушение последнего может не сказаться на первом.

Следует, наконец, помнить, что постулат митогена не обязателен и что в репрессорной модели осциллятор был бы зеркальным отображением осциллятора, изображенного Кауфманом и Вилле. Для того чтобы получить дополнительную информацию по данному, а также другим вопросам, возникающим в процессе этих очень интересных исследований, нужно выделить управляющие молекулы или исследовать слияние клеток, разделенных фильтрами.

Выяснению молекулярной природы постулированного митогена посвящена недавно выполненная работа Бредбери и его коллег (Bradbury et al., 1974 а, b). Исследуя изменение

содержания фосфата в гистоне FI, выделенном из ядер Physarum, они обнаружили заметные колебания в цикле с максимумом в конце фазы как раз перед митозом. Эти данные соответствуют способности препаратов ядер, полученных с помощью ультразвука, фосфорилировать гистон FI тимуса теленка и являются веским доводом в пользу того, что ядерная киназа синтезируется к концу фазы и затем быстро инактивируется в течение М- и ранней S-фаз. Тепловой шок заметно уменьшает фосфорилирование, а Бредбери и др. (Bradbury et al., 1974b) показали, что эти температурные эффекты хорошо согласуются с более ранними исследованиями теплового шока, проведенными Брюером и Рашем (Brewer, Rusch, 1968). Предполагалось, что фосфорилирование гистона FI инициирует конденсацию хромосом, после чего следуют остальные события митоза. Единственным несоответствием между этим предположением и данными Кауфмана и Вилле (Kauffman, Wille, 1975) является то, что, согласно последним исследованиям, можно нарушать митотический процесс, не сдвигая фазу митотических часов; по-видимому, ядерная киназа сама не может быть составной частью осциллятора, управляющего клеточным циклом, хотя и должна регулироваться этим осциллятором.

О взаимоотношениях между ДНК, РНК и синтезом белка у Physarum известно несколько больше, что очень важно для создания детальной картины митотического цикла у этого организма. Однако в данный момент нам достаточно отметить, что эти взаимоотношения сложны и что идентифицировать физиологические сигналы, которые регулируют переходы из одного состояния в следующее, очень трудно. Важно понимать, что ввиду крайней сложности взаимодействий набор сигналов, который управляет переходами из одного состояния в другое, может не быть фиксированным и что при изменении условий скорость - лимитирующими могут стать другие наборы параметров. Поэтому, возможно, лучше рассматривать клеточный цикл в виде совокупности как вероятностных и детерминированных процессов с некоторыми общими ограничениями, налагаемыми на их временную упорядоченность, так и многих событий, которые могут происходить в случайной последовательности. Поскольку ряд переходов от одной стадии к другой может управляться вероятностными, а не детерминированными событиями, вместо моделей типа изображенных на рис. 3.2, основанных на детерминированных осцилляторах, мы можем рассматривать чисто случайные процессы, скажем пуассоновского типа, которые определяют скорость перехода из одного состояния цикла в другое. Далее я кратко рассмотрю такую модель, но в данный момент стоит отметить, что между этими двумя подходами нет антагонизма. Чтобы детерминированный осциллятор (рис. 3.2)

мог удовлетворительно описать реальный процесс, управляющий инициацией репликации ДНК, вариабельность которого 10—20%, необходимо ввести его в «шумовое» биохимическое пространство. Я рассмотрел такую модель для бактериального клеточного цикла (Goodwin, 1970), но применение статистической механики к предельному циклу, используемое здесь для представления осциллятора, сталкивается с рядом трудностей. Проще и лучше использовать исходную модель, которую я исследовал в вышеупомянутой книге и кратко рассмотрел в предыдущей главе, учитывая результаты Фрейзера и Тайвери (Fraser, Tiwari, 1974). Я воспользуюсь ею в следующей главе, для того чтобы выяснить, какие взаимодействия между эукариотическими клетками управляют их ростом. На данном этапе я хотел бы проследить все уровни эукариотической организации на пути к многоклеточным и, в частности, к млекопитающим, где необходимо рассматривать не только жизненный цикл, но и его связь с тканевым гомеостазом, включая явления дифферент цировки клеток и проблему неопластического роста.