Синхронизация клеток

Анализируя рост популяции в хемостате, мы не учитывали того факта, что этот рост на уровне одной клетки есть периодический процесс. Как отмечалось в начале этой главы, существование цикла у каждого члена популяции может привести к возникновению цикличности на популяционном уровне. Один из факторов, который может вызвать такую цикличность, — это наличие внешнего периодического воздействия, период которого достаточно близок к среднему времени генерации клеток для того, чтобы вынудить клетки синхронизоваться с этим воздействием. В качестве примера можно привести исследования,

выполненные мною по синхронизации бактерий Е. coli, растущих в хемостате, куда лимитирующий элемент питания, фосфат, добавлялся один раз за время удвоения (Goodwin, 1969 а, b, с). При росте клеток в хемостате время удвоения определяется скоростью разбавления D, как это видно из уравнения (4.1), поскольку в стационарном состоянии и рост задается выражением

интегрирование которого дает обычную экспоненциальную функцию

Очевидно, что значение t, при котором плотность клеток удваивается, есть такое значение Т, которое удовлетворяет соотношению

или

Таким образом, в стационарном состоянии , что дает связь между скоростью разбавления и скоростью удвоения или временем генерации популяции Т. В моих экспериментах бактерии выращивались на среде с дефицитом фосфата со скоростью роста, соответствующей среднему времени удвоения 90 мин, и каждые 90 мин добавлялось фиксированное количество фосфата. Результаты эксперимента представлены на рис. 4.3, где приведены изменения оптической плотности числа клеток и активности ряда ферментов. При этих условиях достигается относительно высокая степень синхронности клеток — порядка 60%. Достичь более высокой синхронности трудно ввиду вариабельности процесса деления у бактерий. Изменение периода воздействия до значения, отличного от времени удвоения, как и следовало ожидать, заметно уменьшает синхронность.

Тот факт, что клеточное деление начинается сразу после импульсного добавления фосфата к культуре, предполагает, что фосфат необходим для завершения некоторых событий, связанных с образованием поперечной стенки и разделением клетки. Очевидно, внутриклеточный уровень фосфата падает слишком низко для того, чтобы эти процессы могли завершиться, хотя бактерии во время фазы дефицита фосфата продолжают расти, что видно из кривой роста, приведенной на рис. 4.4. Здесь переменные хемостата заменены на эквивалентные переменные непроточной культуры с помощью преобразования , где X обозначает переменную культуры, переменную хемостата,

Представленная кривая относится к ферменту аспартаткарбамо-илтрансферазе. Преобразование переменных делает очевидным тот факт, что остановки роста в хемостате между моментами введения фосфата не происходит. Ясно, что чувствительность разных процессов к уровню фосфата различна, и в действительности без таких различий было бы невозможно синхронизировать клетки с помощью обычного питательного вещества, такого, как фосфат.

Рис. 4.3. Поведение ряда переменных бактериальной культуры, синхронизированной периодическими добавлениями лимитирующего элемента питания, фосфата.

То, что физиология бактерий при этих условиях заметно периодична во всех своих аспектах, очевидно из приведенных на рис. 4.3 кривых, описывающих поведение различных ферментов. Способы использования этой периодичности для исследования динамических аспектов физиологии бактерий рассмотрены в статье Гудвина (Goodwin, 1969 b), в которой изучены характеристики ответов lac-оперона на различные возмущения.

Существует много примеров клеточных популяций как среди одноклеточных организмов, так и в тканях многоклеточных, для которых характерна периодичность по числу клеток, митотическому индексу или индексу включения тритиевой метки. Однако определить непосредственную причину синхронности не всегда удается, так как ситуация весьма усложняется существованием клеточных часов, которые могут сами влиять на клеточный цикл. По-видимому, бактерии не обладают такими часами, и в этом случае ситуация упрощается. Многоклеточные, конечно, имеют

часы, но они обычно локализованы в специализированных органах или железах. Так, 24-часовой митотический ритм, скажем, в эпидермисе или эпителии желудка мыши задается, вероятно, 24-часовым циклом некоторого гормона, ритм колебаний концентрации которого может быть автономным, как ритмическая активность надпочечной железы у хомячка, или же индуцироваться другим периодическим сигналом, возможно нервным, который испытывает автономные колебания.

Рис. 4.4. Переменные хемостата, преобразованные в эквивалентные периодические переменные культуры для наглядного выявления синхронности делений.

Наконец, наблюдаемая периодичность может быть обусловлена внешним фактором, например периодической сменой дня и ночи, без какого-либо участия внутренних часов организма. Рассмотрению этого очень интересного аспекта поведения биологических систем, на котором я подробно остановлюсь позже, были посвящены многие исследования. В данный момент мне хотелось бы кратко обсудить некоторые подходы к анализу периодичности популяции в условиях внешнего воздействия.

Здесь опять удобно начать с общей простой модели клеточного роста в хемостате, а частные случаи в деталях рассмотреть позже. Поскольку нас интересует динамика популяций, определяемая поведением отдельных клеток, необходимо прежде всего встроить в модель клеточный цикл. Это можно сделать следующим образом. Рассмотрим сначала клеточный цикл как одну стадию, по завершении которой клетка делится на две.

Поскольку, как обсуждалось в предыдущей главе, среди клеток, проходящих цикл, существует значительная вариабельность, нам нужна функция, которая задает вероятность того, что клетка, делящаяся в момент , разделится снова в малом интервале . Пусть эта функция будет ; тогда вероятность того, что клетка, которая поделилась в момент , разделится снова в интервале есть Если плотность клеток в культуре равна то число клеток, «рожденных» в прошлом в течение малого временного интервала можно записать как Чтобы найти число клеток, делящихся в малом интервале в настоящем, мы должны сложить все вклады от делений, происходивших в прошлом, взвешенные с помощью функции распределения вероятности и затем умножить все на 2, так как мы предполагаем, что каждая клетка дает две дочерние клетки. В результате получаем соотношение

где относится к отдельным малым временным приращениям в течение которых в прошлом клетки делились. Устремляя так, что приращения становятся бесконечно малыми величинами, мы получаем интеграл

где область интегрирования охватывает весь период развития культуры. Если эксперимент начался в нулевой момент времени, то интеграл можно записать в виде

где является начальным условием. Это уравнение известно как уравнение возобновления. Оно может быть использовано для описания роста клеток в периодической культуре или скорости затухания синхронности как функции вариабельности времени удвоения клеток, которая выражается с помощью функции — функции распределения времени удвоения. Хирш и Энглеберг (Hirsch, Engleberg, 1966) провели интересное исследование этого вопроса, показав, при каких условиях можно получить аналитические решения уравнения (4.13). Другая модель затухания клеточной синхронности, использующая температурную функцию для описания изменчивости времен

генерации, рассмотрена в статье Вули и Де Рокко (Woolley, De Rocco, 1973).

Чтобы распространить уравнение (4.13) на систему со стационарным ростом и возобновлением клеток, каковой является хемостат или живая система, например кровь, необходимо ввести члены, описывающие скорость выхода клеток из сосуда роста или из популяции стволовых клеток. Выведение клеток из сосуда со скоростью разбавления D является пуассоновским процессом, так как он зависит от некоторого случайного события. Вероятность выживания клеток в сосуде роста за период времени t задается членом так что общая вероятность деления для клеток, «родившихся» в момент и все еще присутствующих в течение некоторого более позднего временного интервала равна

Кроме того, нужно учесть также скорость выведения которая аналогична члену в уравнении (4.1). Таким образом, уравнение для роста клеток в хемостате, эквивалентное (4.13), имеет вид

Очевидно, если мы получим уравнение (4.13).

Следующий шаг состоит в том, чтобы подразделить всю цепь превращений, происходящих с системой, на стадии и ввести внешнюю периодичность, так чтобы она влияла на вероятность перехода из одной стадии в другую. Это можно сделать целым рядом способов. Ле Витт (Le Witt, 1972) использовал следующий метод. Он разделил клеточный цикл на три стадии и обозначил их W, U и V. На стадии W плотность клеток, которые ждут момента, чтобы перейти к следующей стадии клеточного цикла, равна Предполагается, что время ожидания зависит от концентрации лимитирующего субстрата s в хемостате и, это именно тот субстрат, который периодически добавляется в модельном машинном эксперименте Витта. На стадиях U и V число клеток на единицу объема равно соответственно, так что полному числу клеток на единицу объема хемостата. Прохождение клетками стадии U, предположительно состоящей из фаз и М, и стадии V, которая является частью фазы определяется функциями распределения вероятностей аналогичными соответствующей функции в уравнении (4.13). Эти две стадии были разделены для того, чтобы придать модели гибкость и вычислить

вероятность перехода из стадии U (т. е. скорость деления клеток), но во многих случаях их можно объединить и описывать одной функцией вероятности перехода, .

Ле Витт предположил, что стадия VV — это пункт управления в клеточном цикле, соответствующий границе между периодами и S, и что прохождение через нее регулируется незаменимой аминокислотой, которая определяет скорость синтеза белка — инициатора синтеза ДНК.

Рис. 4.5. Численное моделирование процесса синхронизации клеток LS в хемостате периодическим добавлением питательного вещества, контролирующего вхождение в S-фазу.

Это предположение основано на том факте, что лишение клеток ткани китайского хомячка аргинина приводит к остановке развития культуры в некоторой точке фазы перед вступлением в S-фазу (Freed, Schatz, 1969). Однако очевидно, что модель можно интерпретировать самыми разными способами. Ле Витт обнаружил, что относительно высокую степень синхронности клеток можно получить, если концентрацию аминокислоты периодически менять так, чтобы период колебаний был равен времени генерации, как показано на рис. 4.5. На этом рисунке можно видеть затухание синхронности в первоначально синхронизированной культуре при помещении ее в окружающую среду с постоянным составом и затем появление синхронности в результате колебаний концентрации

аминокислоты. Синхронность этой системы - 55% - вполне сравнима со значением, полученным Гудвином (Goodwin, 1969) экспериментально в случае бактериальных культур в хемостате.

Рис. 4.6. Влияние уменьшения коэффициента вариации распределения времени удвоения клеток на степень синхронности моделируемой культуры клеток

Ле Витт использовал значения параметров — скорости потребления аминокислот времени генерации , коэффициента вариации времени генерации (0,137), — соответствующие LS-клеткам (предшественникам соединительной ткани у мышей), поэтому полученные им положительные результаты о возможности индукции синхронности в модели подтвердили предположение о том, что клетки могут быть синхронизованы этим способом.

Влияние уменьшения шума или изменчивости клеточного цикла, измеряемого коэффициентом вариации (Ле Витт использовал вероятность перехода с распределением Гаусса), показано на рис. 4.6 (коэффициентвариации 0,1 вместо 0,137). Из рисунка видно, что исходная синхронность затухает медленнее, а уровень синхронизации после начала периодического введения аминокислоты повышается (синхронность становится равной 63,7%). Изменение других параметров, таких, как (концентрации

лимитирующей аминокислоты во втекающей среде), чувствительности синтеза белка-инициатора к этой лимитирующей аминокислоте и времени жизни белка-инициатора в довольно широких пределах мало влияет на степень синхронности. Однако эти параметры все же влияют на стационарное состояние клеточной популяции в хемостате, как это видно из рис. 4.7.

Рис. 4.7. Влияние уменьшения времени жизни белка — инициатора репликации ДНК на стационарное состояние и степень синхронности моделируемой культуры клеток LS.

Здесь время жизни белка-инициатора уменьшено до 2,5 ч по сравнению со стандартным значением 3 ч, поэтому средний уровень белка-инициатора в клетках понижен; клетки медленнее переходят в фазу синтеза ДНК, и стационарный уровень популяции в хемостате понижается. Однако степень синхронности снижается с 55% только до 54,6%. Ле Витт исследовал множество других интересных зависимостей такого рода, и его результаты являются веским доводом в пользу того, что клетки млекопитающих в культуре могут быть синхронизированы этим способом. Несколько иная разработка этой проблемы, основанная на другой системе гипотез, была предложена Франком (Franck, 1970).