Аллостерические свойства ферментов

Сразу после открытия ингибирования конечным продуктом стало ясно, что в основе функционирования ферментов должен лежать существенно новый принцип. Ингибирование ферментативной активности конкурентными ингибиторами было известно

давно и изучалось в течение многих лет; оба явления были достаточно хорошо поняты. Классическим случаем конкурентного ингибирования является действие на сукцинатдегидрогеназную активность малоновой кислоты, стерически подобной янтарной кислоте (рис. 1.3).

Рис. 1.3. Янтарная и малоновая кислоты стерически очень похожи и поэтому конкурируют за активный центр сукцинатдегидрогеназы.

Кинетическая схема взаимодействия фермента Е и его субстрата S и конкурентного ингибитора I следующая. Е соединяется с S, давая промежуточный комплекс ES, который затем превращается в (фермент плюс продукт), т. е.

где мы рассматриваем только начальные стадии реакции, когда количество Р еще недостаточно велико, чтобы была заметна обратная реакция образования ES. Кроме того, фермент соединяется с ингибитором, давая неактивную форму по схеме

Согласно этим реакциям, мы можем записать следующие кинетические уравнения:

и

Имеется также закон сохранения:

где — общее количество фермента, первоначально добавленного в реакцию. В стационарных условиях справедливы уравнения

Из трех уравнений - (1.6), (1.7) и - можно найти [ES] как функцию S и I. Из (1.6) мы получаем

а из (1.7) находим

Подставив отсюда в уравнение (1.8), мы имеем

откуда

Поскольку скорость реакции получаем, что

Предполагая, что субстрат присутствует в избытке, так что его концентрация на начальных стадиях реакции заметно не меняется, мы можем считать S константой и записать соотношение между V и [I] в виде

где Из этого простого выражения сразу видно, как влияют различные концентрации конкурентного ингибитора, например малоновой кислоты, на начальную скорость окислительной реакции, катализируемой сукцинатдегидрогеназой, согласно модели, характеризующейся уравнениями (1.6) — (1.8). График этой зависимости представлен на рис. 1.4. Это перевернутое изображение хорошо известного соотношения Михаэлиса — Ментен между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции, которое можно получить из выражения (1.9), положив график этой зависимости приведен на рис. 1.5. Обе кривые при или соответственно стремятся к своему предельному значению, что характерно для явлений типа поверхностной адсорбции или связывания лиганда, лежащих, как считается, в основе

макромолекулярного катализа. Неконкурентные ингибиторы, например тяжелые металлы или хелаты, действуют на функции фермента неспецифическим образом. Их кинетические эффекты по существу подобны эффектам, описанным для конкурентных ингибиторов, не требуют введения новых принципов функционирования ферментов и дают зависимость между скоростью ферментативной реакции и концентрацией ингибитора того же типа, что и представленная на рис. 1.4.

Ингибирование конечным продуктом, однако, выявляет новый принцип в функционировании ферментов, потому что реакция ингибитора с ферментом является специфической (например, ингибировать аспартаткарбамоилтрансферазу будут только ЦТФ и близкие стерические аналоги), но стерически этот ингибитор совершенно не похож на субстрат фермента. Это ясно из сравнения приведенных на рис. 1.6 структурных формул субстрата и ингибитора аспартаткарбамоилтрансферазы (АКТ), действующего по принципу ингибирования конечным продуктом. Новое свойство ферментов, лежащее в основе их способности узнавать два или более специфических стерических класса

Рис. 1.4. Скорость реакции V, катализируемой ферментом, как функция концентрации неконкурентного ингибитора I.

Рис. 1.5. Скорость реакции V, катализируемой ферментом, как функция концентрации субстрата согласно схеме Михаэлиса — Ментен.

метаболитов, по очевидным этимологическим причинам было названо Моно и Жакобом (Monod, Jacob, 1961) аллостерическим. Произошло это незадолго до того, как интенсивные исследования данного свойства показали, что ферменты — намного более сложная система, чем предполагалось ранее; это заставило полностью пересмотреть кинетику Михаэлиса — Ментен и стимулировало создание новых моделей функционирования ферментов.

Экспериментальные исследования, лежащие в основе этих достижений, начинались с выделения и очистки аллостерических ферментов из Е. соll и изучения их кинетических свойств.

Рис. 1.6. Аспартат, один из субстратов аспартаткарбамоилтрансферазы, структурно совершенно не похож на ингибитор цитидинтрифосфат, действующий по типу ингибирования конечным продуктом.

Герхарт и Парди (Gerhardt, Pardee, 1963) исследовали таким способом аспартаткарбамоилтрансферазу, а Шанжё (Changeux, 1963)-треониндезаминазу. Эти работы выявили, что реакции с участием очищенных нативных ферментов не следуют классической кинетике Михаэлиса — Ментен. На рис. 1.7 представлена зависимость скорости реакции, катализируемой АКТ, от концентрации аспартата (средняя кривая); треониндезаминаза качественно ведет себя подобным образом. Вместо кривой, являющейся частью гиперболы (рис. 1.5), мы имеем кривую с точкой перегиба. Наличие такой, как ее называют, сигмоидной кривой всегда говорит о том, что кинетика данного фермента сложнее кинетики системы, которую можно представить какой-либо моделью с единственным каталитическим центром. Другие свойства, обнаруженные у аллостерических ферментов, оказались еще более необычными и потребовали разработки совершенно новой кинетической теории. Герхартом и Шахманом (Gerhardt, Schachman, 1965) было показано, что различные воздействия на АКТ, сопровождающиеся разрывом водородных связей (например, прогревание при 62 °С в течение 10 мин с последующим

быстрым охлаждением во льду, инкубация с мочевиной, гуанидином или -хлормеркурибензоатом), приводят к тому, что фермент кинетически начинает вести себя в соответствии со схемой Михаэлиса — Ментен (рис. 1.7, верхняя кривая). Потеря сигмоидности, по-видимому, обусловлена диссоциацией фермента на субъединицы — предположение, подтвержденное выделением каталитических субъединиц из раствора обработанного фермента. Следствием этой диссоциации является потеря чувствительности фермента к ЦТФ, ингибитору, действующему по принципу ингибирования конечным продуктом.

Рис. 1.7. Скорость реакции, катализируемой аспартаткарбамоилтрансферазой, как функция концентрации аспартата при различных условиях, описанных в тексте.

В присутствии ЦТФ нативный фермент ведет себя в соответствии с нижней кривой рис. 1.7. Он имеет ту же кинетику, что и нативный фермент в отсутствие ЦТФ, но концентрация субстрата, необходимая для получения скорости, равной половине максимальной и обозначенной возрастает от 6 до 10 тМ, что дает степень ингибирования. После диссоциации фермента каталитические субъединицы больше не реагируют с ЦТФ.

Фракционирование субъединиц фермента и кристаллографические исследования показали, что структура фермента достаточно сложна. Оказалось, что регуляторная субъединица состоит из двух полипептидных цепей (Rosenbusch, Weber, 1971), а в каталитической субъединице имеется три цепи (Nelbach et ai., 1972). Колбергом, Пайджетом и Шахманом (Cohlberg, Piget, Schackman, 1972) была предложена логичная структурная модель нативного фермента, согласно которой каталитические

полипептиды организованы в две системы тримеров с симметрией равностороннего треугольника, а регуляторные полипептиды расположены попарно вокруг каталитических субъединиц, образуя второй, больший равносторонний треугольник. Целостность этой структуры зависит от присутствия некоторых переходных элементов, из которых главную роль играет цинк. Таким образом, мы видим, что нативный фермент — сложная система, высоко организованный макромолекулярный ансамбль со специфическими узнающими центрами для различных молекул, расположенными на разных субъединицах. Поведение целого несомненно отличается от поведения его составляющих, что при попытке объяснить кинетику нативного фермента приводит к постулату о взаимодействии между отдельными частями. Существенной частью процесса является узнавание на молекулярном уровне, с помощью которого центры или специфические группы в макромолекуле взаимодействуют с отдельными метаболитами или лигандами, причем свойства этих центров изменяются при связывании других лигандов с другими центрами той же макромолекулы. Взаимодействия между различными частями одной и той же молекулы обычно интерпретируются как конформационные изменения. Это служит удобным геометрическим представлением того, что, вообще говоря, является перераспределением энергии в макромолекуле.