Гипотеза репрессора инициации

Гипотеза репликона основана на том факте, что для инициации репликации ДНК необходимы какие-то белки. То, что такие белки должны существовать, вряд ли удивительно, но из этого ни в коем случае не следует, что они играют роль нормальных внутриклеточных регуляторов инициации. Возможно, их присутствие — это просто необходимое условие инициации аналогично тому, как наличие фермента в клетке является необходимым условием протекания реакции с заметной скоростью. Как мы видели, сами ферменты не выступают при этом в роли управляющих сигналов в метаболической или эпигенетической системах. Следовательно, наличие инициаторных и репликаторных мутантов отлично согласуется с тем, что окончательное управление инициацией репликации ДНК связано с другим белком, действующим как репрессор инициации. Такая модель находится

в большем соответствии с исходной репрессорно-операторной моделью, чем гипотеза инициатора. Она также дает нам идею способа, которым клетка может измерять свой собственный объем.

Притчард, Барт и Коллинз (Pritchard, Barth, Collins, 1969) высказали предположение, что каждый репликон имеет ген, который кодирует белок, способный предотвращать инициацию репликации ДНК путем взаимодействия или с инициатором, или непосредственно с хромосомой; этот белок работает, следовательно, как репрессор инициации. Они предположили, что ген локализован в ДНК сразу после центра инициации (постулированный ген-репликатор), который для любого данного штамма бактерии находится в фиксированной точке хромосомы. Вскоре после начала репликации ДИК этот ген-репрессор удваивается, и, как предполагается, происходит вспышка синтеза мРНК. Трансляция этой мРНК приводит к появлению белка-репрессо-ра Н, который предотвращает следующий цикл инициации репликации ДНК. Репликация в этом случае происходит с нормальной для нее скоростью, и клетка растет со скоростью, зависящей от условий питания. Концентрация репрессора инициации по мере роста клетки будет уменьшаться, так как предполагается, что после недолгой вспышки синтеза репрессора, которая имеет место сразу после удвоения гена, образование репрессора прекращается и что белок устойчив. Следующий цикл репликации ДНК инициируется только после того, как концентрация репрессора падает ниже некоторого порогового значения, достигаемого при определенных размерах клетки. Таким образом, мы видим, как увеличение размеров клетки причинно связано с управлением инициаций и как клетка «измеряет» свой собственный объем. Концентрация репрессора в клетке растет и падает пилообразно, как это показано на рис. 3.2, причем инициация происходит в точках минимума. Точная форма нисходящей части кривой зависит от того, линеен или экспоненциален клеточный рост; последний вариант и представлен на этом рисунке. Как было показано выше, клеточное деление может произойти в любой конкретной точке цикла, определяемой скоростью роста. Заметим, что клеточное деление не меняет внутриклеточных концентраций и поэтому не влияет на кривую, которая изображена на рис. 3.2. Максимальное значение равно где — порог инициации, так как удвоение клеточного объема к моменту деления вызывает уменьшение концентрации в 2 раза согласно принятым постулатам. Из этой модели имеется ряд следствий, которые рассмотрены в статье Притчарда и др. (Pritchard et al., 1969). Одно из них — зависимость между клеточным объемом и временем генерации g, которая совершенно естественно возникает из их гипотезы. Возможность

получения такой зависимости из постоянства С + D (времени репликации хромосом плюс времени образования перегородки), установленного Хельмстеттером и Купером (Helmstetter, Cooper, 1968), была впервые отмечена Доначи. Не так давно он предложил объяснение регуляции размера клеток в терминах концепции элементарной клетки (Donachie, Begg, 1970; Donachie et al., 1973).

Рис. 3.2. Гипотетический осциллятор, лежащий в основе управления инициацией репликации ДНК в модели Притчарда и др. (Pritchard et al., 1969).

Выберем некоторый начальный объем бактериальной клетки и обозначим его VH. Удобной величиной представляется объем, соответствующий клетке, которая растет со временем генерации мин, так как такая клетка будет иметь одну пару репликационных вилок, инициированных за время каждого клеточного деления. Предположим, что рост отдельных клеток экспоненциален, так что мы можем записать

где g — время генерации клетки. Очевидно, для частного случая мин при мин и клетка разделится. Предположим теперь, что клетка перенесена в более богатую среду, где скорость ее роста вдвое больше и она достигает объема за 30 мин, т. е. раньше, чем закончатся репликация и разделение хромосом Тогда клетка не сможет разделиться при объеме так как репликация и разделение хромосом еще не закончены, и к моменту времени, когда ей представится возможность разделиться, достигнет значительно большего объема. Поэтому когда дочерние клетки действительно разделятся, объем их будет значительно больше, чем VH, а именно

Тогда объем клетки, растущей со временем генерации g, сразу после деления равен

Отсюда видно, что, чем быстрее растут клетки, тем больше клеточный объем, что и обсуждалось в предыдущей главе в связи с данными, полученными Малё и его коллегами при исследовании Salmonella typhimurium.

Используя модель Притчарда и др., мы можем попытаться сделать еще один шаг для того, чтобы найти зависимость между VK и концентрацией молекул репрессора инициации Н в клетке. Предположим, что число таких молекул, синтезируемое в расчете на хромосому, есть а. Исходный объем в этом случае снова равен VH — объему клетки, имеющей только одну репликационную вилку, которая инициируется каждым делением. Тогда концентрация синтезируемого репрессора равна

так как амплитуда изменения есть Подставляя в уравнение (3.1) вместо VH его значение из уравнения (3.2), мы получим

Таким образом, мы имеем зависимость, связывающую размеры клеток, время генерации, исходный объем и пороговую концентрацию репрессора инициации. Это стало возможным благодаря фундаментальным данным Хельмстеттера и Купера о постоянстве (), которое сохраняется в значительном диапазоне времен генерации, хотя и нарушается у очень медленно растущих культур.

Совершенно очевидно, что множество проблем при этих рассмотрениях остается незатронутым и формулируются только некоторые основные черты клеточного цикла прокариотов. Зависимость, установленная между временем генерации и объемом, вносит в схему управления пространственный аспект, хотя и делает это в минимальной степени. Если мы захотим нарисовать схему цепи управления репликацией ДНК, мы должны будем изобрести какой-нибудь метод представления самого процесса роста, в чем до сих пор не было необходимости. Чтобы представить логику модели Притчарда согласно принципам обратной связи, мы можем рассмотреть схему типа изображенной на рис. 3.3, используя обозначения, введенные в двух предыдущих главах.

Здесь мы изображаем рост как «конечный продукт» действия РНК и белка на питательные вещества. Кружок с

обозначает мРНК репрессора инициации Н, который блокирует репликацию ДНК, обозначенную двойной стрелкой. Рост инактивирует Н с помощью простого процесса разведения. Ясно, что это представление неудовлетворительно, поскольку влияние роста на Н не опосредуется специфическим сигналом.

Рис. 3.3. Схема управления связью между ростом и репликацией ДНК у бактерий, основанная на модели Притчарда и др. (Pritchard et al., 1969).

Использование схемы сетей управления полезно и адекватно только в том случае, если стрелки соответствуют идентифицируемым сигналам или информации, опосредованной специфическими молекулами. Поэтому мы теперь вынуждены отказаться от этого представления.

При выводе дифференциальных уравнений, описывающих динамику такой модели, влияние роста учитывается относительно простым способом. Запишем концентрацию некоторых молекул, например определенного типа мРНК, в клетке объемом V в виде

где — число молекул мРНК в клетке. Аналогично запишем концентрацию соответствующих белков как

Изменение У во времени будет описываться следующим уравнением:

Можно считать, что количество синтезируемых в единицу времени белковых молекул пропорционально количеству имеющихся гомологичных молекул мРНК. которое равно предполагая,

как и раньше, что мРНК служит скорость - лимитирующим фактором белкового синтеза. Поэтому, если белок устойчив,

Подставляя это выражение в уравнение (3.4) и записывая У вместо мы получаем

Если рост клеточного объема экспоненциален, то

и уравнение (3.4) сводится к

Для неэкспоненциального роста в производную концентрации белка время входило бы явным образом. Если белок неустойчив и при этом разрушается со скоростью, пропорциональной своей собственной концентрации, в уравнении (3.5) будет присутствовать еще один член, — у Y, так что оно примет вид

Аналогичный подход применим и к другим типам молекул; отсюда видно, что общий вид уравнений не обязательно изменяется при наличии роста, который, если он экспоненциален, входит в них как дополнительный параметр. В следующей главе мы рассмотрим уравнения как для отдельных клеток, так и для клеточных популяций, которые позволят нам исследовать детали клеточного цикла при изменяющихся условиях в культуре. А в последней главе будет представлено аналитическое исследование роста, рассматриваемого как кооперативный процесс.