Периодические режимы у гидроидов

Два аспекта общей теории, развиваемой здесь применительно к морфогенетическим процессам, поддаются четкой экспериментальной проверке. Один из них — это предположение, что мембрана является главным центром первичных морфогенетических процессов, так что изучение свойств биологических поверхностей — их электрической возбудимости, чувствительности к целому ряду мембранно-активных агентов и изменению в составе мембран, обусловленных, скажем, ковалентным связыванием фосфатных групп с мембранными белками, — позволяет подойти к исследованиям раннего морфогенеза. Другой аспект — это предположение о том, что важным моментом формообразующих процессов в развивающихся системах являются повторяющиеся периодические процессы, вероятно связанные с ионными потоками и, следовательно, с электрическими сигналами. Как мы видим, у Dictyostelium discoideum наблюдается четкая периодичность процесса агрегации, а у Pelvetia и Acetabularia зарегистрированы повторяющиеся потенциалы действия, коррелирующие с ранними стадиями морфогенеза. Есть ли аналогичные данные для гидроидов?

Фильмы о регенерации Tubularia, снятые цейтраферной съемкой Дж. Куком и Г. Вебстером на морской биологической станции в Неаполе, выявили следующую последовательность событий в ходе этого процесса. После отрезания гидранта вначале начинается дистальная миграция клеток, и у них появляется тенденция сгущаться в области, находящейся в непосредственной близости от места среза. Эта фаза продолжается почти 5 ч. Затем начинается фаза нерегулярных периодических сокращений; волны сокращения вначале распространяются из разных центров в зоне сгущения, а затем сокращения приобретают характер организованных периодических волн, исходящих из одной пейсмекерной области с периодом от 8 до 10 мин. Это продолжается в течение примерно 8,5 ч, вслед за чем довольно резко наступает фаза неподвижности продолжительностью около 4,5 ч, в течение которой происходит дальнейшая конденсация клеток в предполагаемой области образования щупалец и точках начала морфогенеза. Пейсмекерная область теперь совпадает с центром этой конденсированной зоны. Затем начинается вторая фаза периодических сокращений и распространения волн, которая продолжается около 5ч с последующим периодом покоя. К сожалению, фильм был не полон — отсутствовала часть о периоде развития с этого момента вплоть до полной дифференцировки гидранта. Последняя фаза регенерации состоит из более быстрых сокращений (с периодом в 4—5 мин) и заканчивается пульсирующим появлением готового гидранта из перисарка с активными движениями щупалец после выхода. Сходные явления были зарегистрированы Белоусовым и др. (Белоусов и др., 1972) на Obelia. Жаль, что таким способом не удается исследовать регенерацию Hydra — у нее каждые несколько минут происходят энергичные сокращения тела, маскирующие все морфогенетические движения. Можно предположить, что периодические режимы типа наблюдаемых у Tubularia сопровождают морфогенез, происходящий на основе модели распространения волн, прототипом которого служит агрегация Dictyosielium discoideum. Однако важно понимать, что метаболическая периодичность совсем не обязательно будет приводить к таким движениям клеток в развивающихся системах, которые удастся зарегистрировать, и может оказаться, что выявить предлагаемую периодичность метаболической активности на мембране будет очень трудно.

Другой подход к экспериментальному изучению периодичностей в развивающихся системах основан на возмущении системы каким-либо периодическим сигналом. Эта методика использовалась на Hydra littoralis следующим образом. У больших, откормленных животных отрезали гипостом, затем делали второй разрез дистально к зоне развития (чтобы избежать осложнений,

связанных с образованием почек). Полученные отрезки желудочной части организма нанизывали затем на платиновую проволоку диаметром 40 мкм, которая была изолирована по всей длине, кроме концевого участка в 4 мм. Проволоку пропускали по диаметру через организм (теперь полый цилиндр), располагая ее либо дистально, вблизи разреза, которым был удален гипостом, либо проксимально, вблизи области, где уже была зона почкообразования. На одну и ту же проволоку, которая служила одним из электродов цепи стимуляции, накалывали от 2 до 4 животных. Вторым электродом являлся другой кусочек платиновой проволоки, который помещали примерно в I см от проколотых животных; всю эту систему погружали в среду обитания Hydra, которая по составу близка к озерной или речной воде. Проволочки присоединяли к клеммам стимулятора фирмы Grass, генерирующего импульсы постоянного тока, напряжение и длительность которых можно было менять. Оказалось, что изолированные участки желудка сокращались в ответ на короткий (100 мс) импульс напряжения с амплитудой 4—5 В, но более слабые импульсы не приводили к заметным сокращениям. Поскольку сокращения нужно было исключить, выбрали напряжение 1,5 В, которое, как оказалось, при попадании частот следования импульсов в определенный диапазон вызывает значительное возмущение морфогенеза. Частота задавалась измерителем временных интервалов фирмы Crouzet, который с заданной периодичностью включал стимулятор. Длительность импульса составляла 150 мс, так как оказалось, что импульсы длительностью до 100 мс менее эффективны для генерации морфологических нарушений, тогда как импульсы длительностью от 100 мс до 3 с — наибольшей из испытанных длительностей — по своему действию были одинаковыми. Импульсацию начинали в течение первого часа после нанизывания и продолжали в течение 24 ч. В конце этого периода животных снимали с проволоки и переносили в отдельную посуду. Эксперименты проводились при температуре 21-24 °С.

Было сделано три типа контролей: (1) отрезкам средней части желудка предоставляли возможность регенерировать без возмущения; (2) отрезки в течение 24 ч были наколоты, но не стимулировались; (3) отрезки непрерывно стимулировали при напряжении 1,5 В в течение периода времени, равного суммарной длительности стимуляции за 24 ч, а затем предоставляли им возможность регенерировать без воздействий. Таким образом, если частота следования импульсов в опыте составляла один импульс каждые 2 мин, то постоянная стимуляция, используемая в контроле (3), продолжалась

Пребывание животных в течение 24 ч в наколотом состоянии никак не влияло на регенерацию, за исключением того, что приводило к задержке в 12-16 ч (измеренной до появления щупалец); однако эта задержка находится в нормальном диапазоне изменчивости. Животные, стимулированные непрерывно в течение 108 с или дольше (максимум 3 мин), не регенерировали.

Морфогенетическое нарушение, которое было следствием проксимальной стимуляции с периодом около 0,5 мин, иллюстрируется рис. 5.5, Г.

Рис. 5.5. Появление медиального гипостома в проксимально стимулированной Hydra. Показано одно и то же животное (при разном увеличении) на 2, 3, 4 и 5-й день после стимуляции.

Животное имеет двойную ножку и медиальный гипостом. Картинки последовательно показывают одно и то же животное (фотографии сделаны при разном увеличении) на 2, 3, 4 и 5-й день после окончания 24-часового периода стимуляции. Когда подобное воздействие производилось дистально, частота появления аномалии была значительно меньше. Спонтанная частота возникновения таких нарушений, прослеженная в контроле, составляла 1,5%. Результаты опытов, демонстрирующие ответы на стимуляцию с разными частотами, даны в табл. 5.1. Из всех организмов, считавшихся аномальными, были и такие, которые отличались по внешнему виду от изображенного на рис. 5.5, Г, но все они имели две ножки и один медиальный гипостом. Частотная характеристика ответа проксимально стимулированных животных представлена на рис. 5.6. Максимальное число медиальных гипостомов получается при частоте 1 имп каждые 2,5 мин.

Интерпретация этих результатов в рамках волновой модели очевидна: периодический стимул инициирует волну активности и поэтому вызывает образование градиента вдоль оси организма.

Таблица 5.1

Тот факт, что при дистальной стимуляци аномальные животные довольно редки, в то время как при проксимальной стимуляции их возникает значительно больше, является следствием того, что дистальная стимуляция «усиливает» нормальный градиент от гипостома к подошве, а проксимальная нарушает его. Полученные результаты очень похожи на данные Вилби и Вебстера (Wilby, Webster, 1970), полученные в опытах по пересадкам гипостома к проксимальным концам изолированных пищеварительных зон. Такие пересадки гипостома на 48-72 ч с последующим его удалением также приводили к образованию животных с двойными ножками и медиальным гипостомом. Проксимальные прививки гипостома на срок, больший чем 72 ч, вызывают более полное изменение полярности у животных. В экспериментах с электрической стимуляцией животные, стимулированные более 36 ч, повреждались так сильно, что их регенерация носила ярко выраженный аномальный характер или не происходила совсем. Это свидетельствует о том, что электрическая стимуляция является очень грубым, обладающим разрушительной силой стимулом и что в качестве модели пейсмекера она плоха. Однако наличие довольно острого максимума на частотной характеристике при и относительная эффективность

проксимальной стимуляции по сравнению с дистальной наводят на мысль, что большую роль в этих опытах играют период и расположение мест стимуляции, а следовательно, у Hydra имеется некий пейсмекер. Этот тип экспериментов, будучи усовершенствованным, мог бы дать представление о расположении и природе пейсмекерных центров в развивающихся организмах.

Рис. 5.6. Частотная характеристика генерации медиального гипостома в ответ на проксимальную стимуляцию.

Прекрасный пример использования периодического химического сигнала для управления морфогенезом дают эксперименты Робертсона, Дрейджа и Коэна (Robertson, Drage, Cohen, 1972), в которых воздействие периодических импульсов цАМФ на свободных амеб приводило к их агрегации вокруг этого искусственного пейсмекера.

Очевидно, периодическая модель рассматриваемого нами типа может использоваться как для анализа отчетливо периодических во времени морфогенетических процессов, так и для процессов, у которых видимая периодичность отсутствует. Продолжать описание развивающихся систем, в которых временные периодичности того или иного рода уже обнаружены, только для того, чтобы представить данные в их пользу, не имеет большого смысла. Ценность теории состоит не в детальном соответствии ее современным экспериментальным данным — такое соответствие почти всегда можно получить тем или иным способом; гораздо ценнее ее интеллектуальная мощь, ее простота и, следовательно, способность давать представление об основных принципах, скрывающихся за разнообразием процессов, отдельные свойства которых маскируют общую картину. В заключение следует признать, что высшим арбитром здесь является организм; он выбирает стратегию развития сообразно своим собственным потребностям, а не в соответствии с тем, что нам кажется проще.