Физиология клеточных часов

Период интенсивного исследования природы клеточных часов совпал со становлением молекулярной биологии как основы аналитического мышления в биологии в конце пятидесятых и на протяжении всех шестидесятых годов. Поэтому большинство исследований опиралось на концепции этой науки. Естественным кандидатом на роль клеточного осциллятора, который мог бы лежать в основе работы часов, была одна из цепей отрицательной обратной связи, играющей, как было показано, центральную роль в клеточной физиологии. Однако относительная температурная независимость часов предполагает существование дополнительного звена помимо цепи управления, отдельные стадии которой регулируются метаболическими процессами, такими, как синтез макромолекул и ферментативный катализ, со значениями между 1 и 2. Предполагаемым кандидатом на роль нечувствительного к температуре процесса в часах была диффузия (Ehret, Trucco, 1967). Бактерии слишком малы для того, чтобы диффузия могла оказаться важным участником регуляции, но, к счастью, они исключаются из рассмотрения тем, что, по-видимому, не имеют циркадных ритмов. Таким образом, общая гипотеза, которая казалась наиболее приемлемой, состояла в следующем: макромолекулы, например синтезируются в эукариотическом ядре, затем выводятся в цитоплазму и диффундируют к участкам взаимодействия с рибосомами, после чего синтезируются белки и тоже диффундируют к функциональным участкам, вызывая изменения в состоянии цитоплазмы. Эти цитоплазматические изменения затем передаются ядру и опять с помощью диффузии обеспечивают отрицательную

обратную связь, завершая таким образом цикл. Периоды этих процессов, вероятно, можно сделать равными 24 ч (см. Goodwin, 1963).

Очевидный способ проверки модели этого типа — попытаться остановить часы, затормозив ту или иную стадию цепи событий. Чтобы остановить синтез мРНК и белков, подавить ферментативный катализ и таким образом попытаться исследовать работу постулированных молекулярных осцилляторов в огромном множестве организмов, обладающих циркадными ритмами, были использованы соответственно актииомицин D, пуромицин или актидион и различные ингибиторы ферментов. Результаты многих таких экспериментов опубликованы в сборниках материалов симпозиумов по биологическим часам, например Cold Spring Harbor Symposium, 1960; Circadian Clocks (Aschoff, 1965); Cellular Aspects of Biorhythms (Mayersbach, 1969) и т. д. Несмотря на большое количество очень интересных данных, никакой четкой картины не возникло, и к концу 60-х годов стало ясно, что физиологические основы биологических часов почти так же мало понятны, как и десятилетием раньше. Эта ситуация хорошо описана в книге Бюннинга «Физиологические часы» (Biinning, The Physiological Clock, 1967), которая читается скорее как детективный рассказ, где каждый путь решения проблемы систематически изучается на основе представлений молекулярной биологии и каждый приводит к неубедительному результату, а сами часы постоянно ускользают от исследователя.

Основные трудности в этой области исследований, характерные и для многих других разделов биологии, связаны с проблемой идентификации первичной, а не вторичной или более поздней причины изучаемого процесса. Каракашьян и Гастингс (Каrakashian, Hastings, 1962) покаазли, что актиномицин D в концентрации 0,2 мкг/мл подавляет ритм люминесценции у Gonyau-lax. Поскольку рост в этих условиях тормозился только частично, то очевидно, что какие-то ДНК-зависимые события биосинтеза, связанные с периодической биолюминесцентной активностью, более чувствительны к антибиотику, чем другие, связанные с ростом. В той же статье было показано, что аналогичный результат получается при использовании пуромицина для остановки белкового синтеза. Эти наблюдения, конечно, предполагают, что необходимыми условиями для проявления периодического люминесцентного режима у Gonyaulax является синтез мРНК и белка. Исследования на других организмах показали, что проявлению циркадных ритмов обычно мешают ингибиторы дыхания. Это говорит о том, что для протекания процесса необходима энергия. Однако часто оказывалось, что когда организмы, подвергнувшиеся действию вещества в течение некоторого

периода времени, затем возвращались в нормальные условия, то физиологическая периодичность начиналась снова с той самой фазы, которую она имела бы, если бы оставалась невозмущенной. Это выглядит так, как будто антиметаболит мешает не физиологическому ритму, лежащему в основе функции часов, а выражению некоторого физиологического процесса, который управляется часами, — точка зрения, неоднократно возникающая в анализе Бюннинга (Btinning, 1967). Сами часы, по-видимому, таким воздействием не затрагиваются.

Решающей проверкой первичности действия на сами часы было бы изменение их фазы. До самого недавнего времени единственным антиметаболитом, производящим такой эффект, был арсенит, который вызывал сдвиг фазы в колебаниях свечения у Gonyaulax (Hastings, 1960). Однако это давало слабое представление о механизме часов. Чтобы хоть как-то подойти к решению вопроса о природе физиологического процесса, лежащего в основе биологических ритмов или участвующего в нем, необходим препарат (или препараты), который имитирует сдвигающее фазу действие освещения и для которого известно место его действия в клетке. Такое вещество теперь найдено, и с его помощью изучение биологических часов вступило в новую фазу. Однако до того, как оно было обнаружено, исследования в этой области приводили к ряду парадоксов, единственное разрешение которых состояло в полном отказе от первоначальной системы представлений молекулярной биологии, которые имели такое значение для формирования общей картины в этой области, и принятии нового подхода. На самом деле это возвращало исследователей опять к классическому с точки зрения физиологии подходу. Рассмотрим, как мы приходим в этот кажущийся тупик, представляющийся в виде молекулярно-биологических парадоксов.

Роль ядра в генерации клеточных циркадных ритмов можно прямо исследовать на одноклеточной морской водоросли Aceta-bularia. Это замечательное растение имеет сплошную клеточную стенку и состоит из трех частей: ризоида, который вмещает ядро и прикрепляет растение к его субстрату, круглой шляпки диаметром около 1 см и «стебелька» длиной в несколько сантиметров, который соединяет их. Цитоплазма повсюду непрерывна и заключена в тонком цилиндре стебелька, окружая центральную вакуоль. Активный циклоз перемешивает цитоплазму, которая содержит хлоропласты, митохондрии, рибосомы и другие включения. В следующей главе я рассмотрю некоторые регенеративные и морфогенетические свойства этого организма.

Очень большой размер Acetabularia позволяет измерять физиологические активности отдельных клеток и выполнять эксперименты по пересаживанию ядер, которые практически

невозможны на других типах клеток. Ядро легко удалить, просто отрезав ризоид; на его место можно поместить другое ядро путем прививки другого ризоида к стебельку методом, разработанным Геммерлингом (Hammerling, 1934). Существование циркадного ритма фотосинтетической активности в этом организме было установлено Суини и Хэксо (Sweeney, Нахо, 1961) и Швейгером и др. (Schweiger et al., 1964). Последние исследователи показали, что ритм сохраняется в отсутствие ядра, а согласно Суини и др. (Sweeney et al., 1967), периодическая фотосинтетическая активность сохранялась в энуклеированных растениях даже в присутствии в среде актиномицина D, пуромицина и хлорамфеникола. Таким образом, ни ядро, ни белковый синтез не являются необходимыми для того, чтобы в Aceiabularia работали циркадные часы. Однако если ядра перенесены или с ризоидами, или как отдельные органеллы из одного растения в другое и эти растения находятся в противофазе по отношению к режиму СТ, то через несколько дней культивирования при слабом непрерывном освещении фаза ритма определяется фазой ядра. Кроме того, добавление актиномицина D к растениям с ядрами приводит через несколько дней к исчезновению циркадного ритма фотосинтетической активности. Очевидно, ядро все же оказывает влияние на поведение цитоплазмы, но так же очевидно, что цитоплазма для проявления циркадного поведения не нуждается в ядре.

Химическим веществом, которое дало ключ к решению этой загадки, оказался ионофор валиномицин, который взаимодействует с мембраной, увеличивая скорость поступления в клетки. Бюннинг и Мозер (Biinning, Moser, 1972) обнаружили, что это вещество очень эффективно имитирует освещение в опытах по фазовым сдвигам движения листьев у Phaseolus. Этот факт немедленно обратил внимание на роль мембраны и на изменение ионных концентраций как возможную основу физиологических ритмов. Последние исследования циркадных ритмов у Gonyaulax, выполненные Ньюсом и др. (Njus, Sulzman, Hastings, 1974), а также Суини (Sweeney, 1974 а), подтвердили и дополнили эти данные. Авторы предложили мембранные модели, которые описывают возможный механизм часов.

Одна такая модель, выдвинутая Суини (Sweeney, 1974b) для объяснения парадокса у Acetabularia, состоит в следующем. Важным свойством хлоропластов Acetabularia оказалось изменение их объема в течение суток, что заставляет предположить наличие циркадного ритма проницаемости их мембраны. Суини постулировала, что для ядра также характерно ритмичное изменение состояния, связанное с изменением проницаемости мембраны, и что это обусловливает цикличность обмена веществ между ядром организма и цитоплазмой; эта цикличность лежит

в основе циркадных часов Acetabularia. Есть много способов реализации такого ритма или колебаний, но Суини предполагает, что существуют два метаболита относительно низкого молекулярного веса X и У (не макромолекулы), причем X индуцируется только в цитоплазме с помощью У, в то время как У индуцируется в органеллах метаболитом X. Проницаемость органелл управляется концентрацией X внутри них, и оба вещества распадаются. Поскольку мы провели различие между молекулами в этих двух отсеках, давайте назовем их и Ко (органеллы). Тогда модель Суини может быть представлена следующими уравнениями:

Здесь такие выражения, как представляют скорость движения веществ X и У через мембрану органеллы, проницаемость которой задана функциями от Возможность существования колебательного решения этой системы обусловлена наличием функций проницаемости, которые могут быть существенно нелинейными. Тогда на плоскости мы получим следующую картину (рис. 4.8). Назовем фазой 0 точку О, когда концентрация достигает максимума, а проницаемость мембран органелл — минимума. В органеллах синтезируется , а концентрация из-за распада уменьшается. При распаде мембрана становится более проницаемой для который выходит наружу, что приводит к уменьшению его уровня в органелле. Тогда тоже быстро снизится, затем, когда У в цитоплазме возрастет, индуцирует образование , что приведет к медленному накоплению внутри органеллы и цикл начнется снова. Для будет иметь место такой же, но инвертированный цикл.

Эта модель объясняет тот факт, что циркадный ритм фотосинтетической активности у Acetabularia не зависит от наличия ядра, мРНК и белкового синтеза при условии, что имеются ферменты и предшественники для образования X и У. Она может также объяснить, каким образом такая большая органелла, как ядро, вызывает фазовый сдвиг цитоплазмы в данной фазе цикла. Но она не в состоянии объяснить затухания циркадного ритма в целых растениях под действием актиномицина

D. Как отмечает Суини, для этого нужно ввести дополнительное предположение о том, что в присутствии ядра цитоплазматические белки становятся неустойчивыми, тогда как в его отсутствие они устойчивы. Эффекты сдвига фазы циркадных часов, изменения освещения и температуры объясняются чувствительностью проницаемости мембраны органелл к этим воздействиям.

Рис. 4.8. Изображение предельного цикла на фазовой плоскости

Интересная модель часов, которая подчеркивает роль метаболических отсеков как существенной особенности системы поддержания циркадного ритма, выдвинута Каммингсом (Cummings, 1975; 1976). Он использовал простую метаболическую цепь с петлей положительной обратной связи, которая, как мы видели, вызывает динамические неустойчивости. Метаболиты этой цепи расположены в цитоплазматическом отсеке (клеточная мембрана или кортекс), который медленно приходит в равновесие с цитоплазмой. Именно это медленное достижение равновесия обусловливает длительность периода циркадных колебаний. Уравнения Каммингса (Cummings, 1976) имеют следующий вид:

где - сигмоидная функция, описывающая процесс положительной обратной связи, с помощью которой у ускоряет свой собственный синтез; константы, характеризующие установление равновесия между отсеком и цитоплазмой. Каммингс идентифицировал как цАМФ, а у — как -АМФ, фокусируя таким образом внимание на роли этих метаболитов в механизме циркадных часов. Используя линейную аппроксимацию в окрестности стационарного состояния (х, у), Каммингс показал, что частота осциллятора есть

Считая, что разность между достаточно мала, можно легко получить период длительностью в день. Другой интересной особенностью этого осциллятора является очень малая скорость, с которой увеличивается его амплитуда, когда траектории

раскручиваются к предельному циклу изнутри, — вопрос, к которому мы вернемся позже при обсуждении некоторых экспериментальных данных о поведении часов. Эта модель предлагает много интересных экспериментов, особенно связанных с внутриклеточным распределением цАМФ и 5-АМФ по отсекам. Для более глубокого ознакомления с физиологией часов я рекомендую читателю обратиться также к работе Эдмундса и Кирилло (Edmunds, Cirillo, 1974).

Как же быть с явлением температурной компенсации в биологических часах? Интересное объяснение этого факта было предложено в статье Ньюса и др. (Njus et al., 1974). Они рассматривают детальную модель мембраны на молекулярном уровне, в которой изменение активности ионного транспорта через мембрану обусловлено изменением в расположении и ориентации мембранных белков, четко представленных в жидкостной мозаичной модели Сингера и Никольсона (Singer, Nicol-son, 1972). Регуляторами этих изменений активности и распределения мембранных белков выступают концентрации ионов вне мембраны, что снова приводит к основному механизму действия системы саморегулирующейся отрицательной обратной связи. Поскольку эти мембранные белки относительно устойчивы, модель нечувствительна к ингибиторам макромолекулярного синтеза и к ингибиторам ферментов. Представляется, что циркадная физиология клетки регулируется ионными изменениями, — предположение, которое стало общепризнанным из-за наличия большого числа гормонов, которые, по-видимому, действуют непосредственно на мембраны, и таким образом преобразование первичного, гормонального сигнала происходит с помощью ионных сигналов. Фоторецепторы в мембране влияют на каналы, через которые проходит что объясняет световую чувствительность и замечательную быстроту, с которой световые сигналы индуцируют фазовые сдвиги.

Как полагают, температурная компенсация происходит в результате липидной адаптации. Это явление, которое имеет место во всех пойкилотермных организмах и включает изменения в липидном составе мембраны, постоянно поддерживающие мембрану в жидком состоянии в широком диапазоне температур (см., например, Barenska, Wlodaver, 1969). Ньюс и др. предположили, что основными кинетическими характеристиками механизма часов являются миграция белков и кооперативные взаимодействия между макромолекулами в мембране, а постоянство жидкостных свойств мембраны делает процесс относительно нечувствительным к температуре, за исключением экстремальных значений температур, где функционирование часов, как и многих других физиологических процессов, ухудшается. Эта модель имеет много интересных экспериментальных следствий, давая

при этом очень правдоподобное объяснение физиологического механизма контроля времени на молекулярном уровне.

Таким образом, представляется, что неуловимые биологические часы наконец-то обнаружены и главным их компонентом является мембрана. Модели, выдвинутые Суини (Sweeney, 1974), Ньюсом и др. (Njus et al., 1974) и Каммингсом (Cummings, 1975), идейно просты и изящны и основаны на физиологических принципах, которые не связаны с молекулярной биологией генного управления. Относительная изоляция механизма часов от общей физиологии клетки в теориях, описанных выше, есть результат подразделенности клетки на отсеки и локализации процессов в мембранах, а также независимости его от синтеза макромолекул. В связи с этим возникает интересная проблема изучения кинетических механизмов с большими временами релаксации, в основе которых могут лежать медленная диффузия или процесс установления равновесия, значительно расширяющие динамические возможности метаболической системы включением свойств ее фазовых границ. Это включение поведения мембраны во внутриклеточную динамику будет так же существенно при изучении пространственной упорядоченности, как и в анализе временного порядка.