30.13. Плазмиды и фаг лямбда служат векторами для введения в бактерию чужеродных генов
Следующим этапом в развитии техники получения рекомбинантных ДНК была разработка способов введения чужеродных генов в клетку-хозяина. Наиболее распространенными носителями, используемыми для введения чужеродных генов в геном Е. coli, получившими название векторов, стали плазмиды и ДНК фага X. Плазмиды (разд. 27.15) - это небольшие кольцевые двухцепочечные ДНК, присутствующие в цитоплазме большинства видов бактерий.
Рис. 30-20. Использование терминальной трансферазы для достраивания концов ДНК с целью обеспечения фрагментов ДНК комплементарными липкими концами.
В каждой плазмиде содержится от 2000 до 100000 оснований. Маленькие плазмиды могут присутствовать в клетке в количестве 20 и более копий; плазмид более крупного размера в клетке бывает не более 1-2 копий. Каждая плазмида содержит несколько, а иногда и много генов, которые реплицируются, транскрибируются и транслируются независимо от хромосомных генов, но одновременно с ними. Плазмиды легко выделить и отделить от бактериальных хромосом, от которых они отличаются по размеру, нуклеотидному составу и плотности. Плазмиды обладают двумя замечательными свойствами, полезными для генетического манипулирования. Во-первых, они могут переноситься от одной клетки к другой и даже от бактерии одного вида к бактерии другого. Например, если смешать клетки Salmonella typhimurium с клетками штамма Е. coli, устойчивого к пенициллину, то первые приобретают устойчивость к пенициллину. Это связано с тем, что присутствующий в плазмиде Е. coli ген устойчивости к пенициллину, называемый R-фактором, может передаваться от клеток Е. coli клеткам S. typhimurium.
Второе свойство плазмид заключается в том, что в них можно достаточно легко встраивать чужеродные гены, которые затем в качестве «пассажиров» могут переноситься в Е. coli и становиться там частью генома клетки-хозяина.
Для переноса чужеродного гена в Е. coli можно использовать также ДНК фага X. Если рекомбинантную ДНК фага X, несущую чужеродный ген, смешать с белком оболочки фага X, то образуются инфекционные фаговые частицы, при условии, конечно, что рекомбинантная ДНК по своему размеру не сильно отличается от природной ДНК фага. Этот способ введения чужеродного гена в Е. coli лучше предыдущего, поскольку фаг X чрезвычайно эффективно инфицирует клетку-хозяина, в то время как плазмиды проникают в интактную клетку Е. coli лишь изредка. Фаг X является умеренным фагом (разд. 30.9), и его ДНК вместе с чужеродным геном, который она несет, способна встраиваться в хромосому Е. coli. В этом случае ДНК фага X и чужеродный ген будут реплицироваться при каждом цикле клеточного деления.
Рассмотрим теперь более подробно, каким образом гены выделяют, вводят в клетки-хозяева, клонируют и осуществляют трансляцию с целью получения тех или иных продуктов. Слово «клон» имеет греческое происхождение и означает побег или черенок, применяемый для размножения растения. Оно используется в двух смыслах. Во-первых, под термином клонирование клеток понимают образование группы генетически идентичных клеток, развившихся из одной клетки, как это имеет место в случае линии иммуноцитов, настроенных на синтез определенного типа антител. Под термином же молекулярное клонирование или клонирование генов имеют в виду образование множества идентичных копий гена, полученных в результате репликации одного гена, введенного в клетку-хозяина.
