30.17. Клонирование кДНК можно использовать для поиска соответствующих природных генов
Клонированная описанным выше способом кДНК не идентична природному гену данного белка, поскольку она не содержит интронов, которые обычно присутствуют во многих (если не в большинстве) эукариотических генах, кодирующих белки (разд. 27.28). Вспомним, что после коллинеарного матричного синтеза мРНК на таких генах в ходе обычной биологической транскрипции участки мРНК, комплементарные интронам в ДНК, вырезаются до трансляции мРНК на рибосомах (разд. 28.23). Клонированную кДНК можно использовать для того, чтобы из генома родительской клетки, содержащей тысячи генов, «вытащить» настоящий природный ген, кодирующий данный белок. С этой целью выделяют ДНК исследуемого организма, расщепляют ее какой-либо рестриктирующей эндонуклеазой и встраивают образовавшиеся многочисленные фрагменты ДНК с помощью описанных выше методов в подходящий вектор - обычно в ДНК фага X. Затем рекомбинантные ДНК упаковывают в вирусные частицы, добавляя белок оболочки, и полученными фаговыми частицами, несущими встроенный ген, заражают нормальные клетки Е. coli. Из лизатов этих клеток можно получить много различных вирусных ДНК, которые содержат все (или почти все) гены донорного организма. Из этой «библиотеки генов» природный ген, кодирующий интересующий нас белок, можно выделить простым и специфическим способом: к «библиотеке» добавляют 32Р-кДНК, соответствующую этому белку, смесь нагревают и затем дают ей остыть. При этом между цепями кДНК и природного гена формируются гибридные дуплексы. Хотя в природном гене содержится определенное число интронов, не имеющих комплементарных партнеров в кДНК, его экзоны узнают цепи кДНК и гибридизуются с ними. Образующиеся радиоактивные гибриды можно выделить, извлечь из них интересующий нас природный ген и клонировать его в плазмиде или в фаге X по описанной выше схеме.
Поскольку в настоящее время нуклеотидную последовательность в ДНК можно определить быстро и точно (разд. 27.29), по установленной последовательности кДНК выводят аминокислотную последовательность кодируемого ею белка, а также нуклеотидную последовательность мРНК, соответствующей этому белку. И хотя кДНК не содержит информации о полной нуклеотидной последовательности природного гена, соответствующего эукариотическому белку, тем не менее при помощи меченой кДНК, полученной с мРНК данного белка, природный ген можно выделять и клонировать.
