Вопросы и задачи

1. Механизмы репарации ДНК

а) Как вы полагаете, почему УФ-эндонуклеаза расщепляет ДНК с 5-стороны, а не с 3-стороны от тиминового димера?

б) Почему маловероятно обнаружение таких ферментов, которые исправляли бы поврежденную мРНК столь же эффективно, как репарируется поврежденная ДНК?

в) На основании того, что вы знаете о механизмах репарации ДНК, предположите, каковы будут последствия повреждений гена рентгеновскими лучами, которые часто приводят к разрывам в обеих цепях ДНК?

2. Последствия замены одного основания. Перечислите возможные последствия мутации, вызванной заменой одного основания эукариотической ДНК в участке, кодирующем фермент.

3. Рекомбинация фрагментов, полученных с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Предположим, у вас есть две двухцепочечные молекулы ДНК-А и Б. Цепь 1 ДНКд имеет последовательность

а цепь 1 ДНКБ имеет последовательность

Обе ДНК расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой Eco RI, полученные фрагменты смешивают, чтобы они смогли в смеси перекомбинироваться, и затем ковалентно сшивают с помощью ДНК-лигазы. Напишите последовательности всех ДНК, образующихся после рекомбинации. Укажите, какие из них окажутся новыми рекомбинантами.

4. Кодон UAA в качестве сигнала. Нуклеотидные остатки в прокариотической мРНК нумеруются таким образом, что остатки кодона AUG для инициирующего метионина белкового продукта (состоящего из 140 аминокислот) имеют номера 1, 2 и 3. Какое влияние на белковый продукт оказывает наличие в положениях 330-332, 334-336 и 338-340 триплета (5)UAA? Каким был бы ваш ответ в случае эукариотической мРНК?

5. Построение рестрикционной карты вируса. ДНК, выделенная из вируса, инфицирующего животные клетки, имеет обычное эквивалентное соотношение оснований и устойчива ко всем известным экзонуклеазам.

а) Что говоря вам эти факты о третичной структуре этой ДНК?

б) При расщеплении рестриктирующей эндонуклеазой Есо RI образуется один тип двухцепочечной ДНК с мол. массой Что говорит о структуре ДНК такой результат?

в) При расщеплении исходной вирусной ДНК с помощью рестриктирующей эндонуклеазы Нра I из Haemophilus parainf-luenzae образуются три фрагмента с мол. массами и , которые можно разделить гель электрофорезом. При совместном действии Есо RI и Нра I из исходной вирусной ДНК образуются четыре фрагмента. Самый большой из них имеет мол. массу а самый маленький - . Фрагменты обозначают буквами в соответствии с их размером (А-самый большой). Какова молекулярная масса двух других фрагментов, образовавшихся при совместном действии Есо RI и Нра I?

г) После частичного (т.е. неполного) расщепления вирусной ДНК обоими ферментами из электрофоретической полосы, соответствующей фрагменту с мол. массой выделили ДНК и подвергли ее полному расщеплению с помощью Нра I. В результате получили три полосы, одна из которых обладала электрофоретической подвижностью, соответствующей мол. массе , а две другие полосы соответствовали двум меньшим фрагментам. Составьте возможную рестрикционную карту фрагментов А, Б, В и Г вирусной ДНК и укажите точки расщепления.

д) При полном расщеплении ДНК мутантного штамма этого же животного вируса рестриктирующими эндонуклеазами Есо RI и Нра I образуются только три фрагмента с мол. массами . Каково простейшее объяснение мутации, приведшей к изменению картины расщепления?

6. Функциональные домены в белках. Есть основания считать, что белки эукариот состоят из функциональных доменов, т.е. из независимых областей, каждая из которых определяет какое-либо свойство белка или его функцию. Было высказано предположение, что существование таких доменов выгодно с эволюционной точки зрения, поскольку участки ДНК, кодирующие каждый домен, могут обмениваться и рекомбинировать с образованием новых генов. колирующих белки с новой комбинацией свойств и функций. Какие особенности эукариотической транскрипции могли бы привести к возникновению таких новых генов и почему?

7. Клонирование интерферона человека. Используя рекомбинантные ДНК, можно значительно увеличить наработку белков, присутствующих в клетке в малом количестве. Интерфероны - антивирусные, а возможно, и противораковые агенты - можно выделить из лейкоцитов человека, однако выход интерферона составляет всего 1 мкг из 1 л крови, поэтому при таком выделении он стоит очень дорого. Гены интерферонов можно клонировать и получить их экспрессию в бактериях, которые легко выращивать в количестве сотен и тысяч литров.

а) Подсчитайте, сколько интерферона можно получить в результате клонирования гена интерферона в бактериях, предполагая, что в 1 мл культуры, достигшей стационарной фазы, содержится 109 бактериальных клеток, а в каждой клетке присутствует белка, 5%, которого составляет интерферон.

б) Если мол. масса интерферона составляет 30000, то сколько молекул интерферона вырабатывает одна клетка? (Подсказка: число Авогадро, т.е. число молекул в одном моле вещества, равно )

в) Какое количество клонированного интерферона человека можно теоретически получить из культуры, если учесть данные, приведенные в п. б)?

8. Рекомбинация кольцевых ДНК. Предположим, у вас есть две кольцевые двухценочечные ДНК - одна большая, другая маленькая, которые надо объединить в один кольцевой дуплекс. У вас есть рестриктирующая эндонуклеаза, которая может расщепить каждую ДНК лишь в одной точке с образованием в месте разрыва выступающих концов.

а) Каким образом вы осуществите соединение большой и малой ДНК в одно кольцо большего размера?

б) Укажите структуру основных побочных продуктов рекомбинации.