30.15. Конструирование вектора, несущего ген

Полученную описанным выше способом кДНК можно теперь встроить в плазмиду или вирусный вектор. Для включения кДНК в плазмиду ее необходимо снабдить соответствующими хвостами или липкими концами (рис. 30-21). Это лучше всего сделать путем присоединения к противоположным З-концам двух цепей кДНК ряда повторяющихся дезоксирибонуклеотидных остатков одного типа, например остатков А. Их присоединяют с помощью терминальной трансферазы, которая в присутствии dATP достраивает на обоих концах двухцепочечной кДНК poly(А)-хвост, состоящий из 50-100 остатков. После этого кДНК готова к включению в плазмидный вектор (рис. 30-21).

Сначала плазмиду переводят в линейную форму, расщепляя ее в одной точке рестриктирующей эндонуклеазой с образованием в месте расщепления тупых концов (разд. 27.24). Затем З-концы линейной плазмиды снабжают хвостами, комплементарными тем, которыми были достроены молекулы Если кДНК были достроены poly (-хвостами, то плазмиду следует достроить 3-хвостами из poly(T). После этого линейную плазмиду, обладающую хвостами, и кДНК просто смешивают и предоставляют им возможность образовать пары между комплементарными основаниями. Среди продуктов такой гибридизации будет находиться увеличенная кольцевая плазмида, содержащая новый ген, который связан с плазмидой только за счет комплементарного взаимодействия липких концов. Эти концы можно теперь ковалентно соединить с помощью ДНК-лигазы (разд. 28.12), в результате чего образуется ковалентно замкнутая кольцевая плазмида, несущая новый ген (рис. 30-22).