IV.2. Экспериментальные исследования с РНК-содержащими фагами

Насколько тривиальной может показаться эта игра — после того, как ее результаты рационализированы, — настолько уместна она в природе, определяя информацию, приобретенную на различных уровнях доклеточной и клеточной самоорганизации. Вейсман с сотрудниками провели эксперимент с фагом результаты которого почти точно соответствуют исходу этой игры [32, 33].

С помощью направленного сайт-специфического мутагенеза была получена ошибочная копия фагового генома. Эта процедура заключается в синтезе in vitro минус-цепи фаговой РНК, содержащей в положении 39 от -конца мутантный аналог основания вместо исходного UMP. Используя эту цепь в качестве матрицы и полимеризующий фермент -репликазу, можно было получить инфекционную плюс-цепь, в которой в положении 40 от 3-конца (оно соответствует положению 39 от

5-конца в минус-цепи и локализовано в экстрацистронной области) остаток А замещен на Затем этой мутантной плюс-цепью были инфицированы сферо-пласты и получен урожай мутантных фаговых частиц, которых можно было изолировать из отдельных бляшек. Эксперименты с серийными переносами in vivo (инфекция Е. coli целыми фаговыми частицами) и in vitro (кинетические исследования на изолированных цепях РНК с использованием -репликазы) позволили определить параметры скорости воспроизведения как для фага дикого типа, так и для мутанта-40, а также установить распределения их сателлитов. Метод «отпечатков пальцев» н анализ нуклеотидных последовательностей для ряда последовательных генераций показали, что в мутантной популяции происходят изменения, вызванные образованием ревертантов. Опыты с различными начальными распределениями фага дикого типа и мутанта обнаружили, что в процессе естественного отбора идет конкуренция между единственным доминирующим типом и мутантами. Количественные расчеты указывают на зависимость от данцого селективного преимущества и от параметров распределения мутантной популяции. Селективное преимущество дикого типа по сравнению с данным конкретным мутантом равно

в то время как скорость замещения равна примерно

Это значение определяется скоростью образования ревертантов и, следовательно, относится к следующим (комплементарным) замещениям:

Согласно уравнению (20), факторы качества для плюс- и минус-цепей вносят равный вклад в точность воспроизведения. Замещения и таким образом, эквивалентны. Возможно, они не очень сильно отличаются от замещений н

что обусловлено главным образом сходством «качаний» для взаимодействий и

Поскольку реплицирующий фермент требует развертывания матрицы, чтобы она могла связаться с активным центром, значения вероятно, не зависят от вторичной или третичной структуры матрицы. Опыты in vitro с миди-вариантом РНК [27] дают скорости замещения -которые согласуются со значениями, приведенными выше. Замещения пурин пиримидин и пиримидин пурин, по-видимому, происходят гораздо реже и поэтому не вносят существенного вклада в величину

Определить от труднее, так как эта величина зависит от . Прежде всего обратим внимание на то, что модификация экстрацистронной области, которая не влияет ни на один белок, кодируемый фаговой РНК, существенно изменяет скорость репликации. Спигелман первый подчеркнул важность фено-типических свойств молекулы фаговой РНК в связи с механизмом репликации и отбора. Значение приведенное выше, относится к определенному мутанту и его сателлитам. Другие мутации могут влиять на третичную структуру иным образом, и, следовательно, соответствующие мутанты могут иметь другие скорости репликации. Более того, мутации в интрацистронных областях могут быть летальными и поэтому вообще не давать вклада в Если считать измеренное значение характерным для большей части мутаций, то тогда для максимального информационного содержания получится величина, лишь слегка превышающая действительный размер генома фага который составляет около 4500 нуклеотидов. Такое близкое соответствие кажется подозрительным, и мы сделали определенные оговорки. Однако эти оговорки относятся в основном к значению которое входит в соответствующую формулу только в виде логарифма. При больших тоже был бы получен приемлемый предел для Итак, приведенное значение в конечном счете может быть не так уж далеко от действительности.

Другая серия экспериментов, выполненных Вейсманом с сотрудниками [34], показывает, что в распределении дикого типа присутствует сравнительно небольшое количество стандартного фага. Эти данные заставляют думать, что и что действительное число нуклеотидов на самом деле очень близко к пороговому значению [см. уравнение (18)].

Миди-вариант, использованный в экспериментах Миллса, Спигелмана и др. [7], состоит всего из 218 нуклеотидов и, следовательно, не так хорошо адаптирован к изменениям среды, как конечно, оптимально адаптирован к специальной среде — «стандартной реакционной смеси», использованной в экспериментах in vitro (в которых не требовалось, чтобы молекулы РНК были инфекционны). Однако его реакция на изменения среды, например на добавление ингибитора репликации — этидиум-бромида, — оказалась довольно медленной. Мутант, полученный после 20 переносов, в каждом из которых могло происходить усиление в 105 раз, отличался от миди-варианта дикого типа всего в трех положениях и в новых условиях среды проявлял сравнительно небольшое селективное преимущество. Причиной медленной реакции является то, что 218 нуклеотидам при среднем качестве копирования отдельной буквы 0,9995 соответствуют значения близкие к единице, так что последовательности дикого типа реплицируются очень точно — с образованием лишь сравнительно небольшого количества мутантов из распределения ошибочных копий.

Замечательным результатом этих исследований с теоретической точки зрения является вовсе не тот факт, что пороговое соотношение выполняется как неравенство. Поскольку его вывод основывается на очень общих рассуждениях, любое серьезное несоответствие означало бы, что мы плохо понимаем, что такое дарвиновские системы. Для таких несоответствий нет никаких причин, потому что мы знаем достаточно хорошо молекулярный механизм репликации в таких «прозрачных» системах, как Поистине удивительным результатом является то,

что в действительности значение остается не только ниже порога но и почти совпадает с ним. Число нуклеотидов вполне могло бы лимитироваться не качеством копирования символа а другими факторами, что привело бы к значениям лежащим намного ниже порога, допускающего воспроизводимое накопление информации.

Рис. 11. Цикл репликации, который встречается у РНК-содержащих фагов, ведет к образованию одноцепочечных единиц РНК с высокоспецифичными вторичной и третичной структурами, которые играют роль фенотипических мишеней [11, 34]. Образование полных или частичных дуплексов из плюс- и минус-цепей (так называемых пар Хофшнайдера или Франклина соответственно) предотвращается немедленным закручиванием на себя новосинтезированной цепи. Используя миди-вариант фага Спигелману и др. [35] удалось доказать существование эффектов ингибирования, которые обусловлены образованием дуплексов. Репликация одноцепочечных молекул основана на эффективном взаимодействии репликазы с плюс- и минус-цепями, что требует наличия определенной симметрии третичной структуры фенотипически важных участков.

Итак, мы вынуждены заключить, что эти РНК-содержащие фаги в ходе своей эволюции действительно стремились накопить максимально возможное количество информации, используя при этом также большие экстрацистронные (но фенотипически активные) области генома. Этот факт не исключает того, что при других (например, искусственных) условиях соревнование могли бы «выиграть» молекулы РНК гораздо меньшей длины — такие, как упомянутый выше миди-вариант, или что при других природных условиях существуют гораздо менее сложные жизнеспособные фаги. Еще важнее осознание того, что в природе не существует фагов с (одноцепочечной) РНК, геном которых был бы больше, чем примерно нуклеотидов. Это заставляет полагать, что ферментативный механизм репликации РНК, особенно по отношению к дискриминации оснований или достиг своего оптимума и не может быть далее улучшен. Никакая одноцепочечная РНК не способна поддерживать правильное воспроизведение информации, превышающей то количество, которое по порядку величины эквивалентно 1000—10 000 нуклеотидов (точное значение зависит от

Конечно, с химической точки зрения могут существовать молекулы большей длины, но они не имеют эволюционной ценности. Более того, уравнение (20) предписывает, что требованиям селективного сохранения информации должны удовлетворять как плюс-, так и минус-цепи, хотя только одна из цепей обязана нести генетическую информацию, транслируемую аппаратом хозяина. Эти выводы относятся лишь к молекулам РНК, которые во время своей репликации действуют как одноцепочечные матрицы и для которых был предложен механизм репликации, изображенный на рис. 11 [11].