IV.3. Репликация ДНК

В случае двухцепочечных молекул, особенно ДНК, мы сталкиваемся с совершенно другой ситуацией. Такие молекулы обычно редуплицируются в форме

двухцепочечных единиц, т. е. они могут считаться истинно самовоспроизводящими, по крайней мере в феноменологическом смысле (хотя передача информации и в этом случае основана на комплементарности нуклеотидов).

Рассмотрим вкратце, что известно [10] о воспроизведении таких двухцепочечных молекул ДНК (см. рис. 12).

1. Репликация является полуконсервативным процессом. Двухцепочечная ДНК копируется с образованием двух (совершенно идентичных) дуплексов, каждый из которых содержит одну родительскую цепь.

2. Репликация начинается в определенной точке роста и может распространяться в обоих направлениях. Раскручиванию двойной спирали способствуют так называемые расплетающие белки; некоторые из них были выделены и идентифицированы. Они увеличивают скорость раскручивания на три порядка, в результате репликационная вилка движется сравнительно быстро. В то же время необходимо снимать напряжение кручения, вызванное раскручиванием части молекулы. Существует предположение, что вращение участков молекулы вокруг фосфодиэфирной связи может происходить благодаря разрывам я воссоединениям цепи под действием эндонуклеаз и лигаз.

3. Репликация каждой из двух цепей происходит путем присоединения нуклеотидов в направлении ДНК-полимеразы способны присоединять мономеры только таким уникальным векторным путем, и этот процесс не может протекать на обеих цепях одновременно. Электронная микроскопия с разрешением около 100 А выявила наличие одноцепочечных участков только на одной стороне репликационной вилки; это позволяет думать, что построение второй цепи начинается лишь после того, как возникает значительный промежуток, достаточный для продвижения в направлении

4. Репликация осуществляется короткими дискретными импульсами. У прокариот фрагменты,

(кликните для просмотра скана)

образующиеся за один импульс, имеют длину около 1000—2000 нуклеотидов. Синтез их инициируется затравкой, которой служат очень короткие фрагменты РНК. Участки реплицированной ДНК, располагающиеся вдоль обеих цепей позади репликационной вилки, соединяются затем друг с другом с помощью лигаз.

5. Различные функции, необходимые для репликации ДНК, были идентифицированы путем выделения отдельных ферментов и определения их активности. В частности, было охарактеризовано несколько полимерных комплексов которые выполняют как полимеризующие функции, так и некоторые функции деградации. Здесь особенно интересна -экзонуклеазная активность полимеразы-I. Она обеспечивает избирательное отщепление неспаренного нуклеотида на -конце растущей цепи. Поскольку рост цепи идет только в направлении 5 3, эта экзонуклеазная функция позволяет корректировать новосинтезированные фрагменты. Ее максимальная активность составляет около 2% полимеразной активности. -экзонуклеазу следует отличать от -экзонуклеазы, которая также входит в состав комплекса ДНК-полимеразы-I и, вероятно, участвует в репарации с выщеплением. Она действует только на -конец и расщепляет фосфодиэфирную связь в спаренной области, по-видимому, на расстоянии до 10 нуклеотидов от -конца. Эта экзонуклеаза, следовательно, может выщеплять олигонуклеотиды, тогда как корректирующий -фермент удаляет только отдельные неспаренные нуклеотиды на конце растущей цепи.

Теперь мы можем понять, в чем состоит существенное различие между процессами репликации РНК и ДНК, которое выражается в различии средних факторов качества копирования символов для этих двух процессов. В случае репликации РНК точность передачи информации должна обеспечиваться в непрерывном процессе полимеризации. Как бы ни решала эту проблему РНК-репликаза, она достигает, по-видимому, предельного значения между 0,9990 и 0,9999. Примерно та же точность могла бы

достигаться любым непрерывным механизмом полимеризации ДНК-

Исследование in vitro мутантных фаговых ДНК-полимераз, не обладающих 3' 5'-экзонуклеазной активностью, показало, что эти ферменты сравнительно часто ошибаются — с частотой примерно 1 на каждую тысячу нуклеотидов. Сходные результаты получены для очищенной ДНК-полимеразы из вируса птичьего миелобластоза. Однако есть данные и о меньших вероятностях ошибок. Например, для низкомолекулярных эукариотических ДНК-полимераз, не обладающих корректирующей экзонуклеазной активностью, были получены значения на порядок меньшие, чем в случаях, приведенных выше (одна ошибка на каждые 5—10 тысяч нуклеотидов) [36—39]. Появление фрагмента ДНК длиной 1000—2000 нуклеотидов во время полимеризации ДНК (в прокариотических клетках) может быть прямо связано с ограниченной точностью полимеразной функции. По-видимому, полимераза не может легко удлинять произведенный ею неправильно спаренный конец ([10], стр. 88) — правда, это наблюдалось в отсутствие экзонуклеаз. В то же время -экзонуклеаза, если она имеется, будет опознавать несоответствие и вырезать неверный нуклеотид. Нет никаких оснований предполагать, что оптимальная разрешающая способность на этом этапе сильно отличается от той, которая характеризует процесс полимеризации. Итак, коррекция может снизить вероятность ошибки (в лучшем случае) еще на три порядка. Коррекция ошибок, с другой стороны, не может быть отложена до более поздней стадии, т. е. до завершения синтеза обеих цепей. Хотя системы репарации, использующие -нуклеазные активности, существуют, они не могут установить, которая из двух цепей содержит неправильный член в неправильной паре [36]. Были предложены [40] и проверены экспериментально [41, 42] более детальные механизмы кинетической коррекции (см. обзор [43]).

Итак, можно сделать следующий вывод. Оптимальное среднее качество копирования символа для

(кликните для просмотра скана)

репликации ДНК достигает значения 0,999999 или несколько выше, что позволяет накапливать информацию вплоть до верхнего предела, эквивалентного 1 —10 миллионам нуклеотидов (в зависимости от величины Приятно отметить, что эта оценка совпадает с известными размерами геномов прокарио-тических клеток (например, E.coli - пар оснований). И опять размер геномов любого организма вовсе не обязан быть равным этой предельной величине. Действительные размеры генома могут лимитироваться другими факторами, связанными, например, с упаковкой молекулы в случае ДНК-содержащих фагов, и т. д. Таким образом, как и в случае РНК-содержащих фагов могут реализоваться любые размеры генома ниже порога.

Для содержания генетической информации в про-кариотической клетке существует верхний предел. Любой выход за пределы информационной емкости одноцепочечной молекулы (104 нуклеотидов) требует нового механизма репликации с участием двухцепочечных матриц и корректирующих ферментов. Точно так же новый предел (около 107 нуклеотидов), установленный механизмом репликации ДНК в прока-риотической клетке, не мог быть превзойден, пока не появился новый механизм для дальнейшего уменьшения ошибок. Такой механизм, а именно генетическая рекомбинация, был изобретен природой на прокариотическом уровне. Однако потребовалось от двух до трех миллиардов лет, прежде чем он достиг совершенства, чтобы вызвать новое увеличение количества генетической информации отдельных индивидов.

Процесс генетической рекомбинации, используемый всеми эукариотическими клетками, требует, чтобы два аллеля в их гомологичных положениях были идентичны. Поскольку вероятность ошибки для ферментативной репликации ДНК составляет менее нескорректированные ошибки крайне редки, и в четырех эквивалентных сайтах двух аллелей не может встретиться более одной ошибки. Следовательно, существует дальнейшая возможность

обнаружения и исправления таких ошибок у рекомбинантов, даже если они содержатся в дуплексах, репликация которых была завершена ранее. Одна из возможных схем изображена на рис. 13. Однако механизм рекомбинации в настоящее время неизвестен достаточно подробно; не ясно также, сколько этапов в конечном счете ответственно за дальнейшее снижение вероятности ошибки. Известно лишь, что такое снижение было достигнуто, как показывает анализ эволюционного древа, и что это является важной предпосылкой увеличения генетической информационной емкости вплоть до уровня, характерного для человека.