ПРИМЕНЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ
Диагностика генетических заболеваний получила мощный стимул благодаря последним достижениям в технологии рекомбинантных ДНК. Уже давно известно, что все наследственные болезни обусловлены изменениями в ДНК, однако методы прямого определения нуклеотидной последовательности ДНК появились лишь в последнее время. Например, на основе гибридизационного поиска фрагментов ДНК (Southern, 1975) удалось разработать достаточно
Таблица 7.3. Основные ферменты сыворотки, используемые в клинической диагностике. Многие из приведенных ферментов не являются специфичными для указанных в таблице заболеваний; дополнительные данные об условиях, при которых активность этих ферментов изменяется, приведены в Приложении
чувствительный метод пренатального скрининга наследственных нарушений; с этой целью с помощью ферментов рестрикции проводят картирование ДНК, извлеченной из зародышевых клеток, находящихся в амниотической жидкости.
В принципе можно сконструировать пробы ДНК для диагностики большей части генетических заболеваний. Например, для пренатального выявления талассемии (нарушения в синтезе субъединиц гемоглобина; см. гл. 6) можно синтезировать пробу ДНК по фрагменту гена, кодирующего нормальную субъединицу гемоглобина, и с ее помощью выявить укорочение или отсутствие рестрикционного фрагмента, обусловленное делецией в этом гене. Именно такие делеции характерны для некоторых видов а-талассемии и нескольких редких типов 
и 
8-талассемии (Dozy, Forman, Abuelo, 1979; Kan, Chang, Dozy, 1982). Предложен и альтернативный подход, основанный на конструировании синтетической кДНК, гибридизующейся с р-глобиновой последовательностью, которая содержит нонсенс-мутацию, характерную для некоторых видов Р-талассемии (Pirastu et al., 1984). Отсутствие в плазме а, - антитрипсина—ингибитора протеа — приводит к развитию эмфиземы и раннему циррозу печени. Неактивный а, - антитрипсин был обнаружен с помощью ДНК-зонда, сконструированного на основе неактивного мутантного аллеля гена а, - антитрипсина (Kidd et al., 1983).
Гибридизационные зонды могут использоваться также для обнаружения генетических изменений, ведущих к потере рестрикционного сайта (см. гл. 38). Например, при серповидноклеточной анемии наблюдается точечная мутация в кодоне 
, в результате которой появляется кодон 
такую мутацию в р-глобиновом гене можно обнаружить, взяв для анализа всего 10 мл амниотической жидкости и используя эндонуклеазу рестрикции 
или Sau I (Orkin et al., 1982).
ДНК-зонды можно использовать и для обнаружения последовательностей ДНК, прочно сцепленных с интересующим нас геном, но не принадлежащих самому этому гену. Подобный анализ может применяться и для выявления хромосомного полиморфизма (различий в последовательностях гомологичных хромосом). Расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции дает в таких случаях неодинаковые рестрикционные карты (наборы фрагментов ДНК), свидетельствующие о различиях в последовательностях оснований гомологичных генов. Это явление получило название полиформизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). При рестрикционном анализе обнаруживаются две гибридизационные полосы (если бы гены были идентичны, наблюдалась бы только одна полоса). У потомков, унаследовавших дефектную хромосому, тоже выявляется одна гибридизационная полоса, но ее положение отличается от положения полосы нормальных хромосом. Феномен ПДРФ применялся и для обнаружения гена серповидноклеточной анемии (сцепленного с сайтом рестрикции 
), а также р-талассемии (сцепленного с сайтами рестрикции Hind III и Bam HI) (Little et al., 1980; Woo et al., 1983).
Скрининг, основанный на полиморфизме рестрикционных фрагментов, использовался также для ранней диагностики фенилкетонурии (Woo et al., 1983) (см. гл. 31). Отметим, однако, что сам ген, ответственный за фенилкетонурию, не влияет на распределение рестрикционных фрагментов, однако он тесно сцеплен с сайтом рестрикционного полиморфизма. Перспективы использования полиморфизма рестрикционных фрагментов могут быть связаны с поисками генов, ответственных за то или иное заболевание, которые сцеплены с полиморфным участком. Этот подход уже применялся для скрининга мутаций, приводящих к развитию ретинобластомных опухолей (Cavenee et al., 1983) и болезни Гентингтона (Gusella et al., 1984).
Дальнейшие примеры использования рестрикционных фрагментов в целях диагностики будут даны в гл. 36.
