ОБЩИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В БИОХИМИИ

Этот подход состоит из трех составных частей: 1) выделение биомолекул и органелл, находящихся в клетке (см. предыдущий раздел о субклеточном фракционировании); 2) определение структуры биомолекул; 3) использование различных препаратов для анализа функций биомолекул и их метаболизма (т.е. процессов синтеза и распада).

1. Выделение биомолекул. Как и в случае органелл, для выяснения функции любой биомолекулы необходимо прежде всего получить ее в чистом виде. В табл. 2.5 перечислены основные методы, используемые для разделения и очистки биомолекул. Здесь мы не будем подробно обсуждать их: некоторые из них будут вкратце описаны в других частях книги.

Таблица 2.5. Основные методы разделения и очистки биомолекул. Большая часть этих методов пригодна для анализа компонентов, находящихся в клеточных экстрактах и других биохимических препаратах. Для получения большинства биомолекул в чистом виде, как правило, необходимо последовательно использовать несколько методов. Подробности о применении каждого из методов читатель может найти в соответствующих руководствах

Почти всегда очистить биомолекулы до состояния гомогенности (т. е. до отсутствия загрязнения любыми другими биомолекулами) удается лишь при последовательном применении нескольких таких методов.

Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии зависит от разработки новых методов анализа, очистки и определения структуры. Например, в области биохимии липидов произошел настоящий переворот после введения в практику гаэожидкостной и тонкослойной хроматографии. Анализ мембранных и многих других белков был крайне затруднен до тех пор, пока не появился метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ): применение додецилсульфата натрия приводит к «солюбилизации» (растворению) ряда белков, которые ранее не удавалось перевести в растворимое состояние. После такой солюбилизации уже можно проводить электрофорез. Разработка методов клонирования и секвенирования (определения последовательности мономеров) ДНК произвела подлинную революцию в изучении нуклеиновых кислот и вообще в биологии.

2. Определение структуры биомолекул. После очистки биомолекул можно определить их структуру. Это — совершенно необходимое условие успешного детального изучения корреляции между структурой и функцией. Основные методы, используемые для анализа структуры биомолекул, перечислены в табл. 2.6. Они должны быть знакомы читателям,

Таблица 2.6. Основные методы определения структуры биомолекул

изучавшим органическую химию. Специфичность действия ряда ферментов позволяет использовать их в качестве мощных инструментов для выяснения структурных особенностей некоторых биомолекул. Теоретический и технический прогресс, позволивший повысить разрешающую способность масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии, способствовал тому, что эти методы стали широко использоваться для определения структуры молекул. Например, крайне сложную структуру углеводных цепей, входящих в состав некоторых биомолекул, в частности гликопротеинов, во многих случаях удалось установить с помощью ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Наиболее детальную информацию о структуре биомолекул дают методы рентгеновской кристаллографии. Именно благодаря их использованию была установлена детальная структура различных белков и ферментов, а также открыта двойная спираль ДНК.

3. Изучение функции и метаболизма биомолекул с использованием различных препаратов. Первые биохимические исследования человека и животных проводились на уровне целого организма. В качестве примера можно привести изучение дыхания и судьбы поступающих в организм соединений. Вскоре стало ясно, однако, что целый организм слишком сложен, чтобы можно было получить четкие ответы на различные вопросы. Многие проблемы, возникавшие при работе на целом организме, были устранены после приготовления более простых препаратов и изучения их in vitro. В табл. 2.7 приведены различные типы препаратов, которые используются в настоящее время для изучения биохимических процессов; большинство сведений, содержащихся в этой книге, получено именно на таких препаратах. В таблице препараты перечислены в порядке уменьшения их сложности. Однако использование более простых препаратов тоже имеет свои ограничения. Результаты

Таблица 2.7. Иерархическая последовательность препаратов, используемых для изучения биохимических процессов

экспериментов in vitro могут оказаться ошибочными, например в том случае, когда при гомогенизации клеток высвобождаются ферменты, частично разрушающие исследуемые соединения.

Общая стратегия изучения биохимических процессов

В этой книге основное внимание уделено сложным биохимическим процессам (например, синтезу белков, мышечному сокращению), в том числе и различным метаболическим путям. Метаболический путь — это совокупность реакций, ответственных за синтез сложных соединений из более простых и за распад соединения до конечных продуктов. Тот или иной сложный биохимический процесс или метаболический путь иногда проявляется на уровне целого организма. Примером такого рода может служить сокращение мышц. Мы знаем, что глюкоза является источником энергии для человека и других животных, а это означает, что в организме человека она должна распадаться (подвергаться метаболизму) с выделением энергии. Однако для того, чтобы получить полное представление о том, каким образом происходит метаболизм глюкозы в клетке — а мы такого представления (в частности, о механизме регуляции) пока не имеем , - необходимо провести исследования на других уровнях. На рис. 2.3 представлены различные типы наблюдений и анализа, которые позволяют полностью охватить весь биохимический процесс, такой, например, как распад глюкозы и высвобождение энергии (этот процесс известен как гликолиз). Эта схема в общих чертах применима ко всем основным биохимическим процессам, обсуждаемым в этой книге, и, таким образом, иллюстрирует общую стратегию изучения биохимических процессов; об этом следует помнить, рассматривая любой биохимический процесс (гликолиз, окисление жирных кислот и т.д.).

Дополнительные замечания по препаративной работе и стратегии исследования

Полезно сделать еще несколько замечаний по некоторым позициям, указанным в табл. 2.7 и на рис. 2.3. 1. Возможность артефактов нисколько не снимает абсолютной необходимости выделения и идентификации каждого компонента, участвующего в биохимическом процессе, в чистом виде; без этого невозможно понять, как протекает процесс на молекулярном уровне. Подтверждением этому могут служить многочисленные примеры, которые нам встретятся в дальнейшем. 2. Важно научиться реконструировать процесс in vitro путем систематического подбора индивидуальных компонентов. Если после сборки всех компонентов системы процесс все-таки не идет, это может означать отсутствие какого-то важного компонента, который был пропущен при идентификации и не добавлялся при сборке. 3. Благодаря достигнутым в последние годы успехам в области технологии (например, в ЯМР-спектроскопии и позитронно-эмиссионной томографии) появилась возможность выявлять определенные биомолекулы на уровне обследования целых органов и следить за изменением их содержания во времени. Это позволяет анализировать многие сложные биохимические процессы in vivo. 4. Лишь после того, как наблюдения, выполненные на разных уровнях, дадут согласующиеся между собой результаты, можно с уверенностью говорить о реальных успехах в понимании изучаемого биохимического процесса. Если же при использовании разных подходов возникнут существенные расхождения, следует искать причину этих расхождений до тех пор, пока не будет найдено рациональное объяснение. 5. Описанное выше сочетание разных уровней исследования и разного рода препаратов может использоваться для выявления биохимических изменений у животных, связанных с изменениями метаболизма (например, при ограниченном или усиленном питании) или

Рис. 23. Стратегия изучения метаболического процесса или метаболического пути. Используемая процедура не обязательно должна включать все перечисленные здесь этапы. Однако применение именно этих подходов позволяет обычно выяснить детали биохимических процессов или метаболических путей. Эта схема в общем виде использовалась для изучения главных метаболических путей, рассматриваемых в последующих главах.

с определенными заболеваниями (сахарный диабет, рак). 6. Большая часть описанных выше методов и подходов применима для изучения клеток или тканей человека в норме и патологии. При этом необходимо тщательно следить за тем, чтобы использовались только свежеприготовленные препараты, а кроме того, следует обращать особое внимание на этические вопросы, связанные с проведением экспериментов на человеке.

Использование изотопов в биохимии

Очень большую роль сыграло введение в биохимическую практику изотопов в 1930-х гг. Ранее было очень трудно пометить биомолекулы, чтобы затем следить за их превращениями в ходе метаболизма. В пионерских исследованиях, прежде всего Шонхеймера и его коллег, для решения многих биохимических задач использовались стабильные изотопы , за судьбой которых далее следили с помощью масс-спектрометрии. Например, синтезировали определенные аминокислоты, сахара и жирные кислоты, в состав которых вводили стабильные изотопы, а затем добавляли эти соединения в пищу животным или к препаратам in vitro, чтобы можно было следить за их метаболизмом (определять время полужизни, превращение в другие биомолекулы и т. д.). Именно таким способом были выяснены многие аспекты метаболизма белков, углеводов и липидов. Стало ясно, что метаболизм — очень активный процесс: большая часть соединений в клетке постоянно синтезируется и распадается, хотя скорости этих процессов могут сильно различаться. Суммирование всех этих результатов позволило Шонхеймеру сформулировать представление о «динамической природе метаболизма».

Очень важное значение имело последующее использование радиоактивных изотопов и приборов, позволяющих определять их количество. Стабильные и радиоактивные изотопы, широко используемые при работе с биологическими системами, перечислены в табл. 2.8. Их применение сыграло решающую роль в развитии ряда областей биохимии. Многие исследования простых и сложных биомолекул in vivo и in vitro в значительной мере опираются именно на использование изотопов.

Таблица 2.8. Изотопы, наиболее широко используемые в биохимических исследованиях

Тот прогресс, который был достигнут в последнее время в секвенировании нуклеиновых кислот и в развитии радиоиммунных методов для измерения очень малых количеств соединений в биологических системах, также был обусловлен в значительной степени применением изотопов.