4. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР

Глава девятая. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОБЪЕМНЫХ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР. ВИРУСЫ, ФЕРМЕНТЫ

9.1. Процесс формирования изображений

Происходящие и клетке процессы на молекулярном уровне (связанные, например, с движением, дыханием) сопровождаются изменением пространственной организации структуры. Уникальную возможность увидеть молекулы дает электронный микроскоп.

Разрешение микроскопов достигает 2—3 А, однако биологические объекты не могут исследоваться с таким разрешением. Связано это с необходимостью контрастирования биологических объектов, которые сами слабо рассеивают и поглощают электроны. Из-за неоднородного проникновения контрастирующего вещества внутрь структуры и его деформирующего действия разрешение, достижимое при исследовании биологических образцов в электронном микроскопе, составляет величину около 10—20 А.

Помимо ограничений, связанных с методикой приготовления препаратов, имеются приборные ограничения. Из-за неустранимых сферических аберраций величина апертуры электронного микроскопа мала — примерно 0,01 рад, глубина фокуса при этом составляет величину около 2000 А, что часто превышает толщину исследуемых объектов. Поэтому электронно-микроскопическое изображение представляет собой проекцию на плоскость трехмерной структуры заметной толщины. В этом одна из сложностей исследования пространственной организации молекулярных структур с помощью электронного микроскопа. Трехмерная интерпретация изображений — уязвимое место электронно-микроскопического анализа, так как базируется исключительно на интуиции и опыте исследователя. Часто прибегают к получению снимков структуры в различных ориентациях. Такой прием облегчает получение представления о пространственной организации объекта.

В последние годы появились описания методов количественного восстановления трехмерной структуры по ее электронно-микроскопическим снимкам [1]. Восстановление третьего измерения производится по набору проекций, полученных под разными углами.

Распределения амплитуд на зрачке оптической системы и в плоскости изображения связаны между собой преобразованием Фурье. Для изображений преобразование Фурье дает набор пространственных гармонических колебаний, отличающихся периодом, амплитудой и ориентацией.

Заманчиво применить для описания поведения оптических систем хорошо разработанные в теории передачи одномерных сообщений экономные методы, в частности методы, использующие системы линейных дифференциальных уравнений. Решение этих уравнений — интегральные выражения, связывающие вход и выход устройства, достаточно полно характеризовали бы работу системы. Однако это требует рассмотрения условий, при которых оптическая система будет работать как линейная система [2]. Необходимо, чтобы преобразования, выполняемые оптической системой, отличались только масштабными коэффициентами и не зависели от аргументов функции, описывающей изображение.

Главное условие — это сохранение пропорциональности между входом и выходом системы. При изменении входного воздействия в некоторое количество раз выходной отклик системы должен измениться в такое же количество раз. Если функция воспроизводится на выходе функцией то должна воспроизводиться функцией Таким образом, первое условие требует, чтобы график, иллюстрирующий зависимость выхода оптической системы от ее входа, был прямой линией. Соблюдение этого условия является следствием выполнения принципа суперпозиции в линейной системе. Следует учесть, что регистрирующая система может быть линейной лишь относительно интенсивностей (квадратов амплитуд) светового потока (так как любой фотодетектор является квадратичным), в то время как оптическая система может быть линейной как относительно амплитуд (при когерентном освещении), так и относительно интенсивностей (при некогерентпом освещении).

Второе условие линейности, именуемое условием инвариантности, сводится к тому, что выходная функция не должна менять своей формы при изменении начала отсчета. Для оптической системы это условие предполагает постоянство изображения объекта при его перемещении в поле зрения, т.е. если воспроизводится на выходе то дает на выходе Это условие выполнимо не для всех оптических систем вследствие зависимости величины аберраций от угловых координат. Инвариантность соблюдается в системах, где аберрации достаточно мало изменяются по полю, т. е. в изопланатических системах, или внутри некоторых зон оптических систем (такие зоны называются изопланарными).

Распределение интенсивности в изображении микрообъекта, которое может рассматриватся как выходная функция линейной

оптической системы, представляется интегралом свертки

где распределение интенсивности в плоскости объекта; аппаратная функция рассеяния. (В радиотехнике аналогичная функция носит название импульсной реакции.) Аппаратная функция описывает распределение света в плоскости изображения при наличии в плоскости объекта точечного источника. Под точечным источником подразумевается входное воздействие, интенсивность которого описывается дельта-функцией:

Аппаратная функция, или отклик системы на точечный источник, полностью характеризует поведение системы.

Интегральная форма зависимости (9.1) получена на основе принципа суперпозиции путем суммирования элементарных откликов. Условие инвариантности требует, чтобы характер функции рассеяния не изменялся при перемещении точечного источника в плоскости объекта.

Однако кроме аберраций на аппаратную функцию влияет также положение сигнала во входной плоскости вследствие появления эффекта виньетирования (ограничения пучков), связанного с конечной апертурой используемых линз. Это ограничивает не только положение, но и размеры анализируемых объектов на входе.

Таким образом, процесс формирования изображения объекта в микроскопической системе может быть описан в виде двух последовательных процессов дифракции (вначале на входном зрачке, затем на выходном). Каждый из этих этапов формирования изображения формально описывается преобразованием Фурье (соответственно прямым и обратным). Степень приближения зависит от того, насколько точно система, формирующая изображение, удовлетворяет условиям линейности. Такое описание, естественно, никак не связывается с характером излучения и справедливо как для оптического, так и для любого другого (электронного или рентгеновского) диапазона.

Согласно прямому преобразованию Фурье двумерный спектр изображения объекта определяется так:

Обратное преобразование:

Если учитывать влияние системы формирования изображения, то спектр изображения можно представить в виде произведения спектра объекта и частотной характеристики оптической системы:

в свою очередь, представляет собой преобразование Фурье от аппаратной функции системы.

Выражение (9.3) можно переписать в виде

Таким образом, распределение интенсивностей в выходном изображении является функцией двумерного спектра исследуемого объекта и двумерной частотной характеристики используемой системы.

Другими словами, изображение структуры клетки представляется в виде предела суммы элементарных пространственных гармонических составляющих, частоты которых одинаковы для любых изображений (интегрирование ведется в бесконечных пределах), но амплитуды и фазы выбраны так, что их сумма есть анализируемое распределение яркости. Спектр показывает вклад в эту сумму каждой гармонической составляющей. Используемая для анализа структуры клетки система переносит каждую гармоническую составляющую из плоскости объектов в плоскость изображений с множителем

Так как определяется аппаратной функцией системы, детальный анализ ее двумерной частотной характеристики может быть проведен при решении задачи о дифракции света от точечного источника. В случае, когда такой путь осложнен, имеется возможность определить двумерную частотную характеристику системы по степени деформации выходного волнового фронта.

При образовании изображения в микроскопе за счет явлений дифракции происходит естественное разделение волн, дифрагированных на различных пространственных структурах. Угол, под которым свет дифрагирует на объекте, пропорционален отношению где X — длина волны используемого излучения, период пространственной структуры. При освещении препарата параллельным монохроматичным пучком света (когерентное

освещение) происходит разделение плоской падающей волны на ряд отклоненных под различными углами, являющимися функцией пространственной частоты, плоских волн. Дифрагированные препаратом пучки света концентрируются объективом в его задней фокальной плоскости. Апертура объектива, ограничивающая попадание в микроскоп лучей, дифрагированных под углами, большими определенной величины, по существу и определяет характер двумерной частотной характеристики микроскопической системы при когерентном освещении. Каждая точка задней фокальной плоскости объектива связана с определенным направлением дифрагированной волны, а интенсивность световой энергии: в этой точке отражает удельный вес соответствующей пространственной частоты в формировании изображения. Пространственные частоты имеющие размерность длины, связаны с переменными плоскости спектра, имеющими размерность единиц длины, соотношением

где отсчитывается в направлении, параллельном в направлении, параллельном фокусное расстояние объектива, К — длина волны используемого света.

Таким образом, оптическая система при освещении объекта, находящегося в передней фокальной плоскости объектива, параллельным пучком света осуществляет в задней фокальной плоскости операцию, описываемую двумерным преобразованием Фурье. Эта плоскость, названная Аббе плоскостью «первичного, изображения», является плоскостью двумерного спектра изображения объекта [31.

При исследовании трехмерных биологических объектов лучи, дифрагировавшие на внутренней структуре объекта, создают в дальней дифракционной зоне поле, в котором распределение амплитуд и фаз связано преобразованием Фурье с функцией плотности структуры (х, Эти соотношения между структурой объекта и рассеянным им излучением навели на мысль о возможности математического моделирования структуры на основе данных о распределении амплитуд и фаз в обратном пространстве.

Задачи такого плана довольно распространены в структурных исследованиях и получили название обратных дифракционных задач. Возникают они в тех случаях, например, когда по условиям эксперимента невозможно сформировать увеличенное изображение объекта. Так, с помощью рентгеновых лучей можно наблюдать лишь теневое изображение структуры, отличающееся невысокой четкостью. Объясняется это тем, что нельзя изготовить отклоняющие системы, которые могли бы обеспечить формирование в этом диапазоне четкого изображения. Однако зарегистрировать распределение поля в дальней дифракционной зоне можно, так как

для этого не требуется никакой «оптики». Выполнив обратное преобразование Фурье от распределения амплитуд и фаз в обратном пространстве, можно расчетным путем восстановить облученную структуру.

На этой идее основывается рентгеноструктурный анализ [4, 5]. Одна из сложностей рентгеноструктурного анализа состоит в том, что детекторы, используемые для регистрации рассеянного излучения, квадратичны и не регистрируют фаз. Это, как правило, — фотоматериалы или детекторы, использующие фотоэлектрический эффект. Для математического моделирования структуры необходимо знать распределения не только амплитуд, но и фаз в обратном пространстве. Поэтому фазовая проблема является одной из главных. Решить ее удается пока далеко не для всех объектов, а методы ее решения весьма трудоемки. В области рентгеноструктурного анализа в последнее время активно интересуются возможностью создания когерентных излучателей (лазеров) в рентгеновском диапазоне, которые позволили бы кардинально решить фазовую проблему.

Таким образом, для восстановления трехмерной структуры объектов необходимо знать распределение амплитуд и фаз в трехмерном обратном пространстве. Этому распределению соответствует физическая реальность в виде амплитуд и фаз излучения, дифрагированного объектом. Параметры излучения можно либо измерить в дальней дифракционной зоне — амплитуды непосредственно, а фазы косвенно, как в рентгеноструктурном анализе, либо зафиксировать, как в голографии оптического диапазона. Реконструкция структуры ведется либо расчетным путем, либо восстановлением волнового фронта методами голографии (расчетное восстановление изображения возможно и в голографии: в этом случае информация о распределении амплитуд и фаз должна быть предварительно извлечена из голограммы, а затем введена в вычислительную машину для расчета).