9.2. Математические основы объемной реконструкции

Клуг и Де Розье [6] предложили использовать обратное Фурье пространство для математического восстановления структуры, исследуемой в электронном микроскопе. В электронном микроскопе формируется изображение, которое при определенных условиях может рассматриваться как проекция трехмерной структуры на плоскость, т. е. как интеграл от функции, описывающей распределение плотности в объеме по одной из переменных, совпадающей с направлением просвечивания. Если распределение плотности в трехмерном объекте описывается функцией то изображения, формируемые при разных направлениях

просвечивания, представляют собой двумерные проекции трехмерной структуры на плоскость. Причем распределение плотности в про екциях всякий раз пропорционально интегралу от трехмерной функции. Так, проекция а вдоль направления z пропорциональна выражению Преобразование Фурье от такой проекции представляет собой центральное сечение трехмерного обратного пространства Поскольку распределение плотности в проекции известно, а преобразование Фурье выполняется численным методом, то в центральном сечении обратного пространства будут известны и амплитуды, и фазы. Если теперь объект в электронном микроскопе повернуть на некоторый угол, то электронно-микроскопическое изображение будет представлять собой другую проекцию той же структуры. Преобразование Фурье такой проекции опять будет центральным сечением обратного пространства, но с другим угловым положением. Некоторый набор проекций объекта, снятых в разных ракурсах, при переходе в обратное пространство даст набор центральных сечений. На рис. 103 дана условная схема трехмерной реконструкции объекта по проекциям. Таким образом, имея достаточное количество проекций, можно заполнить обратное пространство пересекающимися по одной прямой плоскостями. Произведя интерполяцию между ними и выполнив обратное преобразование Фурье, можно восстановить распределение плотности в сечениях объекта, плоскость которых совпадает с направлениями просвечивания. Другими словами, можно смоделировать внутреннюю часть структуры, которую не удается увидеть на отдельных электронно-микроскопических снимках, но информация о которой содержится в их наборе.

Если съемка проекции производится относительно фиксированной оси так, что все направления проектирования перпендикулярны к ней, или если сам объект имеет поворотную или винтовую ось симметрии, трехмерная задача сводится к двумерной. В этом случае для каждого из углов проектирования вдоль направления двумерные сечения функции представляются в виде одномерных проекций а на прямую перпендикулярную (рис. 104).

Очевидно, что для несимметричного объекта проекции, отличающиеся на угол , равны и обладают зеркальной симметрией:

Для объектов с четными осями симметрии информативна лишь половина проекций, вторая половина повторяет первую, т. е.

(кликните для просмотра скана)

В общем случае для объекта с поворотной осью симметрия порядка

где

Для объекта с винтовой осью симметрии различные проекции получаются на различных уровнях по вертикальной оси:

где

Рис. 104. Проекция двумерного сечения трехмерного объекта

Таким образом, одна проекция симметричного объекта уже содержит информацию, необходимую для восстановления. Такая проекция в случае поворотной симметрии эквивалентна (для нечетных (для четных проекциям элементарной несимметричной группировки, размножением которой формируется изображение структуры. При наличии винтовой симметрии одна проекция эквивалентна (для нечетных (для четных проекциям, т. е. в ряде случаев можно избежать трудоемкой операции съемки объекта разных ориентациях в электронном микроскопе.

Для структур со спиральной симметрией прямое и обратное преобразования в цилиндрических координатах будут иметь вид:

где взаимные трансформанты Бесселя.

Поскольку исходной информацией является изменение почернения фотографической пластинки, эта непрерывная величина (степень приближения не учитывает зернистой структуры фотослоя) для расчетов должна быть представлена в цифровой форме. Таким образом, каждая из проекций в результате измерений представляется в виде дискретного набора величин а где а - сторона квадрата, на котором ведется восстановление, большая или равная размеру восстанавливаемой структуры. Шаг дискретизации выбирается согласно теореме

Котельникова, распространяемой на случай двумерного изображения с ограниченным спектром. Такое изображение полностью определяется независимыми значениями интенсивности в точках дискретных отсчетов, лежащих в узлах прямоугольной решетки с шагом по оси а; и по оси у, при условии, что спектр пространственных частот изображения равен нулю вне прямоугольника, описываемого в частотной плоскости неравенствами

Число отсчетов, приходящихся на отрезок длиной равно Общее число отсчетов в изображении (число степеней свободы) равно произведению площади изображения на «площадь», занимаемую спектром в частотной плоскости:

В принципе, возможна реконструкция трехмерной структуры по проекциям и без перехода в обратное пространство. Одно из решений состоит в том, что каждая из проекций в дискретном представлении может рассматриваться как сумма значений плотности в одном из узлов решетки, на которой ведется восстановление.

Таким образом, могут быть составлены линейные уравнения вида

с числом неизвестных в каждом уравнении . В общем случае, если имеется проекций то число известных а неизвестных значений есть Условие однозначного определения каждого из значений (т. е. реконструкция одного из сечений структуры): или Решение уравнений вида (9.10) ведется обращением матриц. Для случая, когда величины могут приобретать лишь два значения - или 1, разработаны алгоритмы восстановления, действующие по принципу перебора.

В реальном пространстве справедлив и другой метод трехмерной реконструкции, получивший название метода восстановления обратным проектированием или синтезом проектирующих функций [8]. Идеи метода иллюстрируется на рис. 105, где показано двумерное восстановление функции (в полярных координатах из последовательности проекций расположенных через равные углы Для каждой точки в структуре все проектируемые плотности суммируются. Постоянный фон, возникающий при суммировании, может вычитаться. Однако в таком варианте методу присущи некоторые ошибки.

Поскольку фурье-преобразование представляет собой линейную операцию, то

где

Левая часть уравнения (9.11) соответствует операции «обратного проектирования» плотностей проекции, как показано на рис. 105. Такая операция эквивалентна фурье-синтезу с использованием центральных сечений, причем каждое из сечений соответствует фурье-преобразованию одной из проекций [правая часть уравнения (9.11)]. Оператор представляет обратное фурье-преобразование. рассматривается как двумерная функция; предполагается, что изменения в направлении отсутствуют. представляет собой ли нейное сечение двумерного преобразования по линии, проходящей через начало координат под углом к оси Будем полагать, что спектр функции ограничен, т. е. выше некоторой пространственной частоты, обусловленной в обратном пространстве радиусом фурье-компоненты всех проекций равны нулю, т. е.

Рис. 105. Восстановление «обратным проектированием»

Несложно показать, что результат синтеза представляется в виде

причем -функция единичного веса при углах обратные полярные координаты,

Символ означает операцию свертки

Величина определяет объем объекта в трехмерном случае, или площадь — в двумерном. Q может быть найдена из проекций

Этот член появляется из-за того, что фурье-преобразования всех проекций дают вклад в начале координат Подставляя уравнения (9.11) и (9.13) в уравнение (9.12), получим, что реконструируемая плотность определенная методом обратного проектирования, будет:

где

В этом и состоит ошибка, присущая этому методу. Чтобы увидеть, чем реконструируемая плотность отличается от истинной плотности нужно рассмотреть функцию Функция является функцией с единичным значением на линиях для и поэтому имеет форму одинаково расположенных спиц в колесе с длиной каждой спицы, равной Фурье-преобразование такой функции определяется интегралом от некоторой совокупности бесселевых функций

где

Так как все бесселевы функции имеют максимум при для различных нулевой порядок бесселевой функции в выражении (9.15) для будет также иметь максимальную величину при и поэтому свертка этого члена с истинной плотностью в уравнении (9.14) довольно близка к При бесконечном числе проекций в функции выборки отсутствуют азимутальные вариации, и вместо уравнения (9.15) получаем

где фурье-преобразование кольца радиуса в обратном

пространстве. Таким образом, плотность свертывается с где

В пределе при бесконечном разрешении

Таким образом, даже при бесконечном числе проекций метод реконструкции обратным проектированием не будет восстанавливать истинной плотности а будет реконструировать свернутую с Если исследуемая структура имеет остроконечное распределение плотности, то пики будут восстановлены, так что метод все же даст примерную реконструкцию.

Причина, по которой метод обратного проектирования не может дать действительной реконструкции, состоит в том, что функция производит выборку преобразования объекта в неправильной пропорции для различных радиусов в обратном пространстве. Реконструкция обратным проектированием поэтому эквивалентна фурье-синтезу объекта из его фурье-преобразований со всеми членами, взвешенными пропорционально величине, обратной радиусу в фурье-пространстве.

Модификацию описанного выше способа с целью устранения присущих ему ошибок предложили Б. К. Вайнштейн (модифицированный синтез проектирующих функций [10]) и Рамачандран (метод свертки [11]). Суть модификации сводится к следующему. Если выборочную функцию изменить так, чтобы она меняла свое значение в соответствии с радиусом обратного пространства, то можно осуществить верпую реконструкцию, точность которой ограничена лишь тем, что используется конечное число проекций. Другими словами, все компоненты фурье-преобразования будут включены в реконструкцию с правильным весом, если используемая функция выборки будет иметь вид Фурье-синтез, использующий эту взвешенную выборочную функцию, будет реконструировать истинную структуру. Метод обратного проектирования эквивалентен фурье-синтезу, использующему преобразование с функцией выборки Можно показать, что в реальном пространстве возможен другой процесс, который эквивалентен фурье-синтезу, использующему преобразование с функцией выборки

Согласно теореме о спектре свертки перемножение в обратном пространстве эквивалентно свертке в реальном пространстве. Поэтому реконструируемая плотность может быть восстановлена

точно, если каждая из проекций предварительно свернута со стандартной функцией, а затем суммирование таких модифицированных проекций осуществляется так, как указывалось выше.

Оценка точности восстановления будет зависеть от числа проекций, характера вычислительных операций (степени усреднения, вида интерполяции) и достоверности данных при экспериментальном определении проекций. Восстановление ведется на дискретной сетке, состоящей из узлов с шагом а Условие однозначного определения значения плотности в каждом из узлов: Таким образом, а Кроме того, согласно теореме Котельникова шаг дискретизации определяется наивысшей пространственной частотой объекта ( в декартовых или в полярных координатах). Наивысшая пространственная частота примерно определяется размером минимальной неоднородности объекта. Поэтому разрешение в восстановленной структуре в этом случае будет

Оценить предельное разрешение можно и при переходе в обратное пространство. приобретает нулевые значения выше граничной пространственной частоты Кроме того, шаг выборки в обратном пространстве при восстановлении структуры размером должен быть При заполнении обратного пространства центральными сечениями образуется фигура с радиально расходящимися лучами (типа спиц колеса). При удалении от центра наступает момент, когда расстояние между соседними спицами становится больше шага разбиения Граничный случай при и определяет разрешение

Поскольку амплитуды пространственных частот, близких к граничной частоте, малы, то вклад их незначителен, поэтому предел разрешения, определяемый выражением (9.18), выглядит несколько заниженным. Вообще же оценки уравнений (9.17) и (9.18) достаточно близки. Естественно, что более точную оценку разрешения можно дать при известном характере спектра структуры.

Следует сказать, что метод точного восстановления обратным проектированием (модифицированный синтез проектирующих функций) и метод свертки эквивалентны методу Клуга и Де Розье, который состоит в подсчете фурье-преобразования проекций и затем выполнении обратного преобразования Фурье — Бесселя для восстановления структуры.

Если в первом методе модификация проекций осуществляется в реальном пространстве путем их свертки с преобразованием Фурье от функции выборки с весом, определяемым радиусом обратного пространства, то во втором случае это взвешивание

производится автоматически в обратном пространстве. Оба метода имеют примерно те же ограничения и по разрешению. Однако метод Клуга и Де Розье требует большего времени для вычислений, так как необходимо выполнять два фурье-преобразования.

Итак, мы установили, что для восстановления внутренней структуры объекта, просвечиваемого электронными или оптическими пучками, необходимо иметь набор проекций его структуры, снятой под разными углами (т. е. при съемке объект необходимо поворачивать). Исключение составляют объекты, обладающие симметрией. При восстановлении их структуры иногда достаточно одной проекции.

Следует отметить, что закрепление и поворот объекта размером в доли микрона являются сложной технической задачей. Существующие методы установки препарата в электронном микроскопе принципиально не позволяют достичь больших углов поворота (свыше ±60°). При увеличении углов происходит перекрытие пучка электронов подложкой, на которой располагается наблюдаемый образец. Изготовление микроманипуляторов, которые позволили бы растянуть образец между двумя остриями игл, обеспечивая тем самым круговой обзор при вращении, — дело будущего.

Для иллюстрации описанных выше методов рассмотрим реконструкцию биологической структуры, обладающей спиральной симметрией.