11.5. Оптимизация биохимического эксперимента

Планирование эксперимента

Поскольку учет информации о частичных гидролизатах ведет к уменьшению числа ребер в «графе молекулы» (см. рис. 122), то необходимо использовать фрагменты, позволяющие ликвидировать ребра графа, которые порождают неединственность пути. В одних случаях можно с достаточной определенностью указать требуемый продукт частичного гидролиза и именно его выделять из смеси, например когда один из порождающих неоднозначность элементов входит в концевой продукт.

В других случаях по нуклеотидному составу случайно выбранного частичного гидролизата можно определить, содержится ли в нем элемент, порождающий неоднозначность. Если такого элемента нет, то проводить анализ этого частичного гидролизата не имеет смысла. Планирование эксперимента может быть также облегчено, если в последовательности имеются минорные нуклеотиды (рис. 124).

Определение первичной структуры РНК блочным методом использует перекрывание нуклеотидных последовательностей продуктов различных полных гидролизов. Нуклеотидная последовательность продуктов определяется для каждого гидролиза, и, таким образом, последовательность нуклеотидов в участках

Рис. 124. Длила последовательностей нуклеотидов, восстанавливаемая однозначно 1 — два полных гидролизата; 2 — три полных гидролизата; 3 - четыре полных гидролизата, 4 — доля однозначно восстанавливаемой последовательности длины и

перекрывания определяется несколько раз. В ряде случаев можно устранить такое дублирование [133, 134].

Так, если участок перекрывания имеет характерный нуклеотидный состав, то по известной последовательности этого участка в продукте одного из полных гидролизов можно определить, в каком из внешних продуктов другого полного гидролиза он содержится. Если невозможно выбрать одно решение, то проводится биохимическое определение последовательности в указанных продуктах.

Использование нескольких полных гидролизов

Математическая формулировка критерия единственности слова позволяет определить, какую среднюю длину нуклеотидной последовательности можно однозначно восстановить по данным только нескольких полных гидролизов.

К решению этой задачи можно подойти с двух сторон. Во-первых, можно считать, что нуклеотидные последовательности представляют собой случайно выбранные последовательности из четырех символов [118, 119]. Но такой подход оставляет в стороне возможную неслучайность реальных нуклеотидных последовательностей. Поэтому были использованы уже расшифрованные первичные структуры нуклеиновых кислот [138]. Для этих последовательностей проводилось их условное разбиение на продукты полных гидролизов по каждому из нуклеотидов

Таблица 11 (см. скан) Эффект, применения математического метода с использованием трех полных гидролизов для однозначного восстановления первичной структуры РНК

Подсчитывалось, какая часть последовательностей данной длины восстанавливается однозначно. Сглаженные кривые результатов этого анализа приведены на рис. 124.

Средняя длина доля однозначно восстановимых последовательностей длины равняется для двух гидролизов 18 нуклеотидам, для трех — 36, для четырех — Для четырех гидролизов не удалось получить всю кривую из-за малого числа длинных молекул РНК, расшифрованных к настоящему времени.

Таким образом, использование каждого нового полного гидролиза, специфичного к одному нуклеотиду, увеличивает среднюю длину последовательности, однозначно восстановимой по данным только полных гидролизов, примерно в два раза.

В табл. 11 приведены данные, позволяющие сравнивать количества биохимической информации, необходимой для однозначного восстановления структуры трех РНК традиционными методами, использующими два полных гидролиза, и математическим методом, использующим три полных гидролиза. Из табл. 11 видно, что число различных продуктов трех полных гидролизов больше, чем двух полных гидролизов примерно в полтора раза. Однако число олигонуклеотидов, структуру которых надо определять биохимическими методами, уменьшается. Использование описанных методов позволяет в 5—18 раз уменьшить количество продуктов частичного гидролиза, необходимое для достижения однозначности.

Поскольку получение и анализ продуктов частичного гидролиза — одна из наиболее сложных и трудоемких биохимических операций, то значительное уменьшение их числа свидетельствует об эффективности разработанных методов. Можно надеяться, что использование математических методов восстановления слов позволит значительно продвинуться вперед в определении первичной структуры нуклеиновых кислот.

ЛИТЕРАТУРА

(см. скан)

(см. скан)

(см. скан)