АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ

Один из способов определения структуры белка включает его гидролиз, а затем качественный и количественный анализ образовавшейся при этом смеси аминокислот. Ниже обсуждается несколько методов такого анализа.

Тонкослойная хроматография

Смесь известных аминокислот наносится в виде пятна на стеклянную пластину, покрытую тонким слоем оксида кремния или оксида алюминия (рис. 15-2). В качестве пластины можно также использовать специальную бумагу без всякого покрытия. Пластину помещают в стеклянную камеру, на дно которой налито небольшое количество растворителя. Благодаря действию капиллярных сил растворитель начинает постепенно подниматься по пластине, увлекая за собой компоненты нанесенной на пластину смеси. Различные вещества движутся по пластине с различными скоростями. Относительная скорость движения компонентов смеси определяется относительной полярностью вещества, покрывающего пластину (неподвижной фазы), и растворителя (подвижной фазы). Например, если подвижная фаза малополярна, то менее полярные аминокислоты будут

Рис. 15-2. (см. скан) Тонкослойная хроматография: 1 — стеклянная или алюминиевая пластина, покрытая тонким слоем неподвижной фазы или нанесенное на точку старта пятно анализируемой смеси; 3 - стеклянная камера; 4 - крышка; 5 - растворитель (подвижная фаза) растворитель медленно поднимаете и по пластинке; фиолетовые (после обработки нингидрином) пятна аминокислот: 7 - лизин; 8 - пролин; 9 - серин; 10 - тирозии; 11 - место, где должно было бы оказаться пятно аланина, которого в анализируемой смеси нет; 12 — точка старта

двигаться по пластине сравнительно быстро, тогда как более полярные аминокислоты будут сильнее удерживаться неподвижной фазой. Различие в скорости движения приводит к разделению смеси на компоненты. После того как фронт подвижной фазы достигнет верхнего края пластины, ее вынимают из камеры, высушивают и опрыскивают раствором специального вещества - нингидрина. При этом бесцветные (и потому невидимые) аминокислоты образуют фиолетовые комплексы с нингидрином, что позволяет увидеть пятна аминокислот на пластине. Зная заранее положение на хроматограмме пятен каждой из двадцати аминокислот (при использовании определенных подвижной и неподвижной фаз),

легко определить, какие именно аминокислоты содержатся в исследуемой смеси. На рис. 15-2 показана хроматограмма смеси тирозина, серина, пролина и лизина.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) позволяет провести лишь качественный анализ белков или смесей аминокислот. Очень приблизительно относительное содержание аминокислот в смеси можно оценить по интенсивности окраски пятен. Чем темнее пятно, тем выше содержание аминокислоты в изучаемом образце.

Электрофорез

Еще одним методом определения аминокислот служит электрофорез, который имеет значительное сходство с ТСХ. Анализируемую смесь аминокислот помещают в центр расположенного горизонтально бумажного листа, который смочен буферным раствором, обеспечивающим желаемое значение рН. Под действием внешнего электрического поля молекулы аминокислот, в зависимости от знака заряда, начинают двигаться либо к катоду, либо к аноду (рис. 15-3, табл. 15-3). Если значение рН буферного раствора выше данной аминокислоты, то аминокислота существует в виде аниона и в электрическом поле будет двигаться к аноду. Наоборот, если аминокислота находится в катионной форме и будет двигаться к катоду. Чем больше разница между тем быстрее (дальше) будет двигаться аминокислота. В табл. 15-3 приведены значения и относительные подвижности некоторых аминокислот при

На рис. 15-4 показана электрофореграмма, полученная после проявления нингидрином.

Электрофорез используется для анализа смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белков. В некоторых случаях электрофоретическое обнаружение необычных аминокислот в плазме крови позволяет поставить больному правильный диагноз.

Рис. 15-3- Схема установки для электрофореза: а - вид сбоку; б - вид сверху; 1 — бумажный лист; 2 — пятно исследуемой смеси; 3 - буферный раствор

Рис. 15-4, Электрофореграмма: 1 — точка старта; 2 — лейцин; 3 — фенил аланин; 4 — аспарагиновая кислота; 5 - лизин

Анализ аминокислот с помощью автоматического анализатора

На рис. 15-5 показана принципиальная схема аминокислотного анализатора, который позволяет устанавливать как качественный, так и количественный состав смесей аминокислот, полученных в результате гидролиза белка.

Белок, чей аминокислотный состав анализируется, смешивают с соляной кислотой. Нагревание смеси приводит к гидролизу белка до аминокислот. Затем смесь аминокислот пропускают через колонку, заполненную оксидом алюминия или ионообменной смолой. В колонке аминокислоты разделяются и выходят из нее с различной скоростью. Разделенные аминокислоты смешивают с нингидрином и снова нагревают для ускорения образования окрашенного комплекса. Затем раствор проходит через фотометр, который регистрирует наличие и интенсивность окраски и изображает график зависимости оптической плотности раствора от времени. Поскольку время удерживания каждой из двадцати аминокислот в колонке известно, можно установить, какие именно аминокислоты входят в состав исследуемого белка. Площадь пика пропорциональна количеству данной аминокислоты, что позволяет установить относительное содержание аминокислот в белке.

Аминокислотный состав белка может быть установлен несколькими способами. После гидролиза белка до аминокислот смесь последних можно анализировать с помощью тонкослойной хроматографии или электрофореза. Оба эти метода дают только качественный состав смеси аминокислот. С помощью автоматического аминокислотного анализатора можно установить и качественными количественный аминокислотный состав белка.

Таблица 15-3. (см. скан) Относительные подвижности некоторых аминокислот в электрическом поле

(кликните для просмотра скана)