13.13. Метаболические пути могут быть идентифицированы в прямых опытах

Для того чтобы выявить последовательность химических реакций, составляющих тот или иной метаболический путь, можно воспользоваться тремя главными экспериментальными подходами. Первый из них, наиболее прямой, заключается в изучении метаболического пути in vitro (в пробирке), т. е. не в самой живой ткани, а в ее бескпеточном экстракте, сохраняющем способность катализировать весь исследуемый процесс в целом. Еще в середине прошлого века стало, например, известно, что дрожжи сбраживают глюкозу до этилового спирта и . Однако изучение отдельных стадий этого метаболического пути, поставляющего анаэробным дрожжевым клеткам почти всю необходимую им энергию, началось по-настоящему только с 1898 г., когда Эдуард Бухнер обнаружил, что отжатый из дрожжей сок, не содержащий живых клеток, тоже способен сбраживать глюкозу до этилового спирта и (разд. 9.1). Позже выяснилось, что брожение в таких экстрактах происходит лишь при добавлении неорганического фосфата и что по мере потребления глюкозы этот фосфат исчезает из экстракта. Оказалось, что в среде накапливается при этом какое-то фосфорилированное производное гексозы, обладающее всеми теми свойствами, какими должен обладать один из промежуточных продуктов на пути превращения глюкозы в этиловый спирт и . После того как этот промежуточный продукт был идентифицирован, в дрожжевом экстракте удалось обнаружить фермент, превращающий его в другой продукт. Этот последний в свою очередь был выделен и идентифицирован. Таким образом, идентифицированными оказались уже два промежуточных продукта расщепления глюкозы. Добавляя к эстрактам ингибиторы ферментов, исследователи добивались накопления других промежуточных продуктов. В конце концов благодаря комбинированию такого рода приемов удалось выделить и идентифицировать 11 метаболитов, представляющих собой промежуточные продукты спиртового брожения глюкозы.

Все 11 ферментов, катализирующих эту последовательность реакций, были выделены и очищены. Этот же прямой метод применяется и при изучении других метаболических путей. Он позволяет идентифицировать один за другим промежуточные продукты данного процесса и ферменты, катализирующие их образование и распад. После выявления всей последовательности реакций процесс может быть воспроизведен в пробирке с использованием очищенных компонентов.