15.14. Каким образом можно выявить регулируемые этапы гликолиза в интактных клетках?

Различные регуляторные эффекты на таких аллостерических ферментах, как фосфофруктокиназа, легко можно наблюдать в пробирке в опытах с очищенными ферментными препаратами.

Рис. 15-15. Некоторые факторы, от которых зависит аллостерическая регуляция фосфофруктокиназы мыши. А. Влияние концентрации АТР и фруктозо-6-фосфата на скорость фосфофруктокиназной реакции. При низких концентрациях АТР величина фосфофруктокиназы для фруктозо-6-фосфата сравнительно невелика, и потому этот фермент даже при относительно низких концентрациях фруктозо-6-фосфата может функционировать с большой скоростью. При высоких концентрациях АТР фермента для фруктозо-6-фосфата резко возрастает, о чем свидетельствует S-образная форма кривой. Б. Влияние АМР, цитрата и фруктозо-1,6-дифосфата. Фруктозо-1,6-дифосфат является мощным активатором, но для максимальной стимуляции ему требуется присутствие АМР. Цитрат же действует как мощный ингибитор. Здесь представлены лишь немногие из тех сложиых взаимодействий, которые могут иметь место между многочисленными аллостерическими модуляторами фосфофруктокиназы.

Возникает, однако, естественный вопрос: откуда, в сущности, нам известно, что фосфофруктокиназная реакция представляет собой один из главных регулируемых этапов гликолиза в интактных клетках? Получить ответ на этот вопрос позволяют измерения, показывающие, как в интактных клетках или тканях изменяются концентрации различных промежуточных продуктов гликолиза при изменении скорости этого процесса. Обратимся вновь к рис. 15-13. Представим себе, что мы имеем дело с покоящейся мышцей и что гликолиз на всем пути от глюкозо-6-фосфата до пирувата протекает в ней с постоянной скоростью, так что и концентрации всех его промежуточных продуктов тоже постоянны, т.е. поддерживается стационарное состояние.

Попробуем теперь внезапно ингибировать фосфофруктокиназную реакцию. При этом резко повысится концентрация ее субстрата, т.е. фруктозо-6-фосфата, который станет накапливаться, и понизится концентрация продукта этого фермента, фруктозо-1,6-дифосфата, а также всех последующих промежуточных продуктов гликолиза, поскольку их превращение в пируват будет продолжаться с той же скоростью, что и раньше. Этап, на котором происходит превращение фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1.6-дифосфат и о котором известно, что концентрация первого из этих веществ возрастает, а второго - снижается, если фосфофруктокиназа ингибируется, может служить конкретным примером пункта перекреста. Пункт перекреста является тем местом, в котором осуществляется регуляция данной ферментной системы при ее переходах из состояния покоя в состояние активности и обратно. Рис. 15-16 поясняет роль пункта перекреста с помощью аналогии на модели гидравлической системы. Измеряя концентрации различных промежуточных продуктов какого-либо метаболического пути и выясняя, как изменяются эти концентрации в ответ на изменение общей скорости данного метаболического пути в интактной ткани, мы можем таким способом установить, какие именно из реакций этого метаболического пути регулируются. С помощью этого методического подхода было установлено, что главным регуляторным этапом гликолиза в скелетных мышцах, мозге и прочих тканях является фосфофруктокиназная реакция. Для того чтобы определить и сравнить концентрации всех промежуточных продуктов данного пути в покоящихся и в стимулированных клетках, пользуются следующим способом. Клетки или ткани быстро замораживают в жидком азоте и тем самым подавляют в них ферментативную активность (этот метод получил название «фиксация замораживанием»). Затем из замороженной ткани экстрагируют промежуточные продукты с помощью какого-нибудь кислого реактива, который вызывает денатурацию и инактивацию ферментов, и определяют концентрации этих промежуточных продуктов в тканевых экстрактах.

Рис. 15-16. Гидравлическая модель, поясняющая роль пункта перекреста в регуляции гликолиза, протекающего в мышце. Измерение концентраций последовательных промежуточных продуктов гликолиза в активной интактной мышце [А) и в мышце, находящейся в состоянии покоя (Б), позволяет выявить регулируемый этап этого процесса. Пункт перекреста - это реакция, катализируемая ферментом, для которого при переходе мышцы из активного состояния в состояние покоя концентрация субстрата возрастает, а концентрация продукта (продуктов) снижается. В данном случае пунктом перекреста сложит реакция, катализируемая фосфофруктокинаэой (ФФК), от которой зависит скорость образования пирувата. Гглюкоза: Г6Ф глюкозо-6-фосфат; Ф6Ф-фруктозо-6-фосфат; ФДФ - фруктозо-1,6-дифосфат; ТФ триозофосфат; 3ФГ -фосфоглицерат. Здесь показаны не все промежуточные продукты гликолиза.

В любой данный момент времени при данных условиях скорость расщепления глюкозы (или гликогена) до пирувата определяется только одной из регуляторных реакций гликолиза. Почему же в таком случае в гликолизе регулируется не одна реакция, а несколько? Объясняется это тем, что метаболизм - очень сложный процесс. При определенных метаболических ситуациях клетке выгоднее регулировать скорость гликолиза за счет скорости вовлечения в гликолиз остатков глюкозы, т.е. через гексокиназную или гликогенфосфорилазную реакцию. В других условиях более выгодной для клетки может оказаться регуляция через фосфофруктокиназную или пируваткиназную реакцию. Поскольку метаболические активности и функции, а также «топливные смеси» в различных тканях и клетках не совсем одинаковы, гликолиз при разных метаболических условиях может регулироваться в них через разные регуляторные пункты. Наличие нескольких регуляторных пунктов на центральном гликолитическом пути обеспечивает клетке большую метаболическую гибкость.

Важно иметь в виду и два других обстоятельства, касающихся регуляции гликолиза и вообще любого метаболического пути. 1) Регулируемые этапы какого-либо метаболического пути при внутриклеточных условиях обычно необратимы. Фосфорилаза, гексокиназа, фосфофруктокиназа и пируваткиназа - все эти ферменты катализируют реакции, сопровождающиеся в условиях клетки значительным уменьшением свободной энергии и потому практически необратимые. 2) Почти все другие, т.е. нерегулируемые. ферментативные этапы гликолиза находятся в состоянии равновесия или близки к нему. Однако, поскольку гликолиз включает необратимые этапы, весь этот процесс в целом также должен быть необратим. В интактной клетке многие отдельные ферментативные реакции могут быть близки к равновесию, однако в целом ни сами живые организмы, ни их метаболические функции никогда не находятся в состоянии равновесия.