§ 3. Функции распределения клеток по размерам

Наряду с распределением микроорганизмов по возрастам исследователи большое внимание уделяют функциям распределения по размерам. Фактически индивидуальный возраст клетки не поддается непосредственному измерению (если не иметь дела с синхронной культурой), тогда как размеры клеток определяются достаточно точно. Существует несколько различных методик определения размеров клеток, простейшей из которых является измерение линейных размеров по микрофотографиям, снятым со специально" приготовленных мазков [15].

Используются также более совершенные методы, дающие возможность построения практически непрерывных кривых распределения. Например, метод Коултера основан на измерении проводимости раствора в сосуде, разделенном на две части перегородкой с микроотверстием; при прохождении единичной живой клетки через отверстие проводимость раствора изменяется пропорционально объему этой клетки (подробнее см. монографию [16], а также [17, 18]). В настоящее время созданы автоматизированные устройства для комплексного статистического анализа клеток, соединенные с ЭВМ.

Таким образом, получение экспериментальных кривых распределения клеток по размерам не встречает в настоящее время существенных трудностей. Более сложным является установление связи формы кривых распределения с физиологическим состоянием клеток и условиями их выращивания. Этому вопросу посвящены теоретические работы, содержащие модели роста клеточных популяций, распределенных по размерам. Наиболее последовательная теория ведет свое начало от работы Икмана и др. [19] и целой серии статей Белла и Андерсена [20], где из закона сохранения числа клеток выводится уравнение неразрывности для плотности распределения клеток по массам или по возрастам и объемам.

На основании перечисленных выше работ запишем уравнение неразрывности для функции распределения клеток по объемам (см. [11]). Пусть число клеток, имеющих в момент времени объем в интервале Общее число клеток в проточном культиваторе обозначим через Тогда

Полная производная по времени от должна быть равна сумме «источников» и «стоков»:

Первый член в левой части уравнения (4.33) представляет изменение функции со временем, второй — изменение, связанное с ростом клеток. Обозначим через скорость прироста объема индивидуальной клетки

Убыль клеток в единицу времени из данного размера складывается из выноса их со скоростью протока гибели со скоростью и деления на дочерние клетки с удельной скоростью Будем считать, что гибелью клеток можно пренебречь, так как Последний член в (4.33), обозначенный функция источника, описывающая прибыль клеток за единицу времени в данный размер за счет деления родительских:

объем родительской клетки; произведение и есть число клеток в интервале делящихся за единицу времени; функция описывает долю дочерних клеток размера полученных из родительской Суммарная прибыль клеток в размер за счет деления родительских выражается интегралом по всем клеткам, для которых

Если при делении каждой родительской клетки получается -дочерних, мы должны записать:

Для бактерий в большинстве случаев можно считать, что родительская клетка делится на две дочерние и при этом точно пополам, тогда выражается через -функцию:

Для почкующихся клеток можно предположить, что почка отделяется от материнской клетки тогда, когда отношение ее размера к суммарному достигает некоторого предельного значения а. В этом случае функция будет иметь вид

т. е. клетки после деления прибывают в разные размеры: дочерняя — в размер а материнская — в размер

Введем далее нормированную функцию распределения поделив на полное число клеток:

Учитывая (4.32), имеем условие нормировки для функции

Кроме полного числа клеток нас будет также интересовать другая макроскопическая характеристика культуры — концентрация биомассы в культиваторе объема Введем у — плотность вещества клетки, тогда масса клетки объема будет и

Вместо уравнения (4.33) запишем систему двух уравнений, описывающих динамику числа клеток и изменение нормированной функции распределения клеток по размерам. Будем считать, что клетки делятся на две дочерние, т. е. Тогда

Запишем также соответствующее уравнение для концентрации биомассы:

Условие нормировки (4.37) заменяет граничное условие для функции распределения Функцию источника для бактерий, делящихся точно пополам, вычислим на основании выражений (4.35) и (4.36):

Задача определения законов распределения клеток по размерам будет полностью определена, если задать начальное число клеток в культиваторе начальное распределение по размерам и считать известными функции и и

Будем решать стационарную задачу, т. е. предположим, что параметры системы не зависят от времени и культура в хемостате находится в равновесии: Для стационарного распределения получим из (4.40) (положив )

обыкновенное дифференциальное уравнение:

Условие сохранения числа клеток в культиваторе при дает соотношение

где слева стоит прибыль клеток в единицу времени за счет деления, а справа — убыль за счет вымывания. Условие сохранения массы клеток приводит к известному соотношению между скоростью протока и удельной скоростью роста в стационарном состоянии:

Отметим, что для определения решения достаточно использовать любые два условия из трех - (4.37), (4.44), (4.45), третье условие должно приводить к тождеству.

Для решения задачи необходимо задать скорость роста индивидуальной клетки и скорость деления. В литературе имеются противоречивые данные о законах роста клеток; по-видимому, разнообразие экспериментальных данных свидетельствует о том, что различные виды микроорганизмов в разных условиях могут расти по-разному. Поэтому рассмотрим два частных случая.

1. Клетки растут экспоненциально:

2. Объем клеток в промежутках между делениями увеличивается с постоянной скоростью:

Далее, нам надо выбрать модель клеточного деления для определения функции удельной скорости деления. По аналогии с возрастными моделями (см. формулы (4.17)-(4.20) § 3) введем функцию распределения размеров делящихся клеток которая имеет смысл плотности безусловной вероятности деления клетки, достигшей размера Связь функции с плотностью вероятности деления клетки при условии, что клетка достигла размера не разделившись, будет

Подчеркнем здесь еще раз, что под мы имеем в виду априорную вероятность для клетки разделиться по достижении

размера эта вероятность не должна зависеть от других причин убыли клеток — вымывания, гибели и т. п.

Связь между и скоростью деления и в случае однозначной зависимости т. е. при заданном законе роста клетки можно получить из соотношения

Таким образом,

Рассмотрим сначала идеальный случай: все клетки делятся пополам, достигнув определенного размера Распределение размеров деления в этом случае представляется в виде

а скорость деления, как следует из (4.48), равна нулю при и становится бесконечно большой при Решение уравнения (4.43) в предположении экспоненциального роста индивидуальной клетки

Рис. 4.8. Кривые распределения числа клеток по объемам в случае деления при фиксированном размере . По осям отложены безразмерные величины

В случае линейного роста клетки (4.47) аналогичные вычисления дают

Таким образом, нормированное распределение в обоих случаях определяется лишь максимальным объемом клетки и не зависит от параметра Характер функции несколько меняется в зависимости от выбора закона роста отдельной клетки. На рис. 4.8 видно, что при экспоненциальном законе роста (кривая 1) функция распределения имеет более крутой спад, чем при линейном (кривая 2).

Перейдем теперь к более реалистической ситуации, когда размер деления является случайной функцией. При этом определение стационарного нормированого распределения усложняется, так как даже в случае деления клеток точно пополам в правой части уравнения (4.43) для стоит функция источника в

«упреждающей» точке: а в случае, когда дочерние клетки неравнозначны, функция источника будет выражаться интегралом (4.35).

Приближенное решение задачи в предположении гауссова распределения размеров деления и размеров дочерних клеток проведено в работе [21]. Используя несколько вариантов законов роста индивидуальной клетки (экспоненциальный, линейный, инверсный, кусочно-линейный), авторы рассчитывали теоретические кривые распределения клеток по массам для шести значений скорости протока Параметры распределений и скоростей определялись (по методу наименьших квадратов) при сравнении с экспериментальными кривыми распределения.

Отметим здесь также направление моделирования, где элемент случайности вводится не в закон деления клетки, а в закон роста. В работе [22] предполагается, что размер I клетки возраста есть случайная величина, распределенная по нормальному закону с коэффициентом вариации, не зависящим от возраста. Тогда, предполагая линейный рост клетки, а также детерминированный размер материнской и дочерней клеток в момент почкования, авторы получают в интегральной форме закон распределенная клеток по размерам, в котором три параметра остаются неизвестными и подбираются при сравнении с экспериментом.

Мы в работах [23—25] решали аналогичную задачу в более простом варианте — деления бактерий-палочек точно пополам.

Рис. 4.9. Плотность распределения вероятностей деления клетки: а) условной, б) безусловной.

Рис. 4.10. Удельная скорость деления клетки. Сплошная линия — экспоненциальный закон роста клетки, пунктир — линейный.

Предполагая, что все клетки имеют одинаковый диаметр и растут только в длину, в силу линейности уравнений мы можем вместо распределения по объемам записать аналогичное распределение по длинам Учтем только, что в (4.38) у — это масса, приходящаяся на единицу длины клетки.

Выберем в качестве закона распределения размеров деления ступенчатую функцию

т. е. предположим, что клетка не может делиться, пока не достигнет размера для больших же размеров условная вероятность деления (при условии, что клетка не разделилась раньше) не зависит от длины (рис. 4.9, а). Тогда безусловная вероятность (или функция распределения размеров деления) будет согласно (4.48) (рис. 4.9, б)

Удельная скорость деления (рис. 4.10) будет связана с функцией через скорость роста клеток В случае клеток, экспоненциально растущих в длину, имеем аналогично (4.49)

Для линейно растущих клеток будет, соответственно,

Запишем теперь уравнение, которому удовлетворяет нормированная функция распределения клеток по длинам в предположении деления клеток точно пополам. Из (4.43) получим при замене на I:

Для случая экспоненциального роста, подставив и учитывая соотношение получим

Для случая линейного роста клетки уравнение для функции распределения будет

где А — средний размер клетки: а скорость роста связана со скоростью протока и параметрами функции деления соотношениями

Точно решить уравнения (4.57), (4.58) не представляется возможным, так как в правую часть уравнения для входит неизвестная функция в «упреждающей» точке Для приближенного расчета можно ввести максимальную возможную длину клеток так что при (удобно выбрать На участке в уравнениях (4.57), (4.58) функция источника отсутствует и можно найти соответствующее аналитическое решение.

Рис. 4.11. Распределение клеток по длинам при экспоненциальном законе роста. По осям отложены безразмерные величины Расчет проводился при

Используя его в качестве функции источника, можно машинными методами найти решение на предыдущем участке и далее последовательно на всех остальных участках вплоть до На рис. 4.11 приведено семейство вычисленных по подобной методике безразмерных кривых распределения для ряда значений безразмерного параметра при экспоненциальном законе роста, а на рис. 4.12 — при линейном. На последнем рисунке сплошными линиями проведены кривые, рассчитанные в предположении пунктиром — при Как видно из рисунка, увеличение практически не привело к изменению приближенного решения.

Сравнение теоретических зависимостей с экспериментальными кривыми распределения тифозных бактерий-палочек по размерам [15, 23—25] показало, что подбором безразмерного параметра (или двух размерных параметров можно добиться

хорошего совпадения теории с экспериментом как в предположении экспоненциального роста, так и линейного. Пример такого подбора приведен на рис. 4.13.

Рис. 4.12. Распределение клеток по длинам при линейном законе роста. Сплошные линии — пунктир

Однако оптимальные значения параметров А соответствующие разным теориям, при этом оказались несколько различными, поэтому ответ на вопрос: по какому закону растут клетки? — может быть дан лишь в том случае, когда функция распределения «размеров деления» будет определена из независимых экспериментов.

Рис. 4.13. Сравнение экспериментального распределения тифозных бактерий-палочек по длинам (ломаная линия) [12] с теоретическим, вычисленным по линейной теории (плавная кривая):

Итак, мы изложили в этом параграфе модели, в которых исследуется распределение микроорганизмов по размерам. Экспериментальные функции распределения нашли широкое применение для управления микробиологическим производством, в частности, для контроля стабильности культуры [26]. Сочетание модели с экспериментом позволит изучить более полно законы роста индивидуальных клеток, найти связь физиологических характеристик клеток с условиями роста культуры в целом.

Внедрение машинных методов в обработку экспериментальных данных, о чем мы упоминали в начале параграфа, дает основание надеяться на успехи в этом направлении.