§ 3. Модель регуляции клеточного цикла

Рассмотрим сначала модель, описывающую химические процессы в липидном слое мембраны; к ним относятся:

1. Окисление липидов кислородом с участием свободных радикалов. При этом образуется промежуточное состояние, в котором липиды сами являются радикалами, т. е. процесс размножения радикалов — автокаталитический. Реакция свободно-радикального окисления липидов хорошо изучена (см. [19]). Выделены отдельные стадии (их около десяти), определены константы элементарных процессов и характерные концентрации радикалов. Последние по порядку величины равны , а характерные времена «полуобновления» радикалов порядка секунд.

2. Удаление из мембраны липидов, окисленных до перекисного, уже не радикального состояния. (Частичное обновление липидов может осуществляться и без предварительного окисления.)

3. Внедрение в мембрану новых липидов (либо вновь синтезированных, либо хранящихся в липосомах) с помощью специальных" белков-переносчиков. Отметим, что в клеточной мембране имеется около двадцати сортов липидов, отличающихся строением фосфатной головки. По свойствам их можно четко разделить на две группы. К первой относятся такие, как фосфотидилсерин; относительное содержание их невелико, но они легко окисляются и одновременно являются легкоплавкими; далее мы будем называть их активными липидами. Характерное время «полуобновления» активных липидов порядка десяти часов. Ко второй группе относятся пассивные липиды, такие, как, например, сфингомиелин. Они обновляются значительно медленнее, за времена порядка нескольких суток, так что содержание их можно считать постоянным.

4. Процесс окисления липидов регулируется слабыми радикалами — антиоксидантами (соединениями типа токоферола). Взаимодействие их с радикалами ведет к аннигиляции тех и других; помимо этогоантиоксиданты могут спонтанно инактивироваться или удалятьсяиз мембраны. Антиоксиданты поступают в клеточную мембрану за счет сторонних источников. Характерные концентрации их в мембране порядка миллимолей, а характерные времена их «полуобновления» порядка минут.

Математическая модель процесса окисления липидов в мембране на основании изложенного должна содержать переменные трех типов: концентрации радикалов, активных липидов и антиоксидантов. Число промежуточных продуктов радикального типа, как упоминалось, около десяти. Среди них можно выделить наиболее медленно меняющиеся компоненты и, используя теорему Тихонова, свести число переменных этой подсистемы к трем: концентрации радикалов перекисного типа концентрации антиоксидантов и концентрации активных липидов (Мы опускаем детальное описание этой процедуры ввиду ее громоздкости.) После этого модель в безразмерной форме приобретает вид [16]

Характерные времена эволюции переменных составляют: Концентрации и отнесены к своим характерным значениям и потому порядка единицы; того же порядка параметры . Обсудим природу различных членов в (7.1). Положительные константы описывают экзогенный приток всех трех компонентов, члены соответственно, удаление липидов из мембраны, дезактивацию радикалов и спонтанный отток антиоксидантов. Нелинейные члены описывают аннигиляцию радикалов с антиоксидантами рекомбинацию радикалов. Член окисление липидов радикалами (положительный знак этого члена во втором уравнении отражает автокаталитический характер процесса). Параметр скорость окисления, в принципе, зависит от температуры, вязкости липидного слоя и, следовательно, от его физического (фазового) состояния. Однако в этом разделе мы будем считать его постоянным.

Таким образом, модель (7.1) учитывает основные свойства исследуемого процесса: автокаталитическое размножение радикалов и их аннигиляцию (друг с другом и с антиоксидантами), а также эволюцию липидов.

Ввиду большого различия времен система (7.1) может быть упрощена. Однако наиболее быстрый процесс (второе уравнение) нельзя принять стационарным, поскольку изоклинная

поверхность содержит неустойчивые участки. Промежуточный (по скорости) процесс (7.1в) всегда устойчив и его можно исключить, положив

Редуцированная система примет вид

Отметим, что здесь мы встречаемся с несколько необычными условиями применения теоремы Тихонова, когда исключаемый процесс не является наиболее быстрым. В связи с этим различие в поведении исходной системы (7.1) и редуцированной (7.3) несколько больше, чем в обычном случае. Можно показать, что в нашем случае эта процедура оправдана.

Рис. 7.2. Фазовый портрет системы (7.3).

Система (7.3) — релаксационная, поскольку аттрактором является изоклина В области параметров эта изоклина имеет -образный характер, представленный на рис. 7.2. В силу релаксационности системы траектория либо стелется по устойчивым ветвям аттрактора, либо срывается и стремится к ним параллельно оси абсцисс. Из фазового портрета видно, что возможны следующие режимы поведения системы:

I. Стационарный устойчивый режим в области малых и больших Он возникает в случае, когда изоклина (линия а на рис. 7.2) пересекает левую устойчивую ветвь аттрактора. Этот устойчивый режим является ждущим, т. е. при конечном возбуждении происходит переброс точки за максимум аттрактора (за счет увеличения или при этом совершается цикл и система возвращается в исходное состояние. При малых возбуждениях система в силу устойчивости возвращается в исходное состояние сразу без цикла. Сопоставляя это свойство модели со свойствами клеточного цикла, можно сказать, что рассматриваемый режим соответствует состоянию покоя

II. Устойчивое состояние при малых и больших Оно реализуется в случае, когда изоклина расположена достаточно высоко; этот режим также является ждущим (линия в на рис. 7.2). Ему можно сопоставить состояние покоя Автоколебательный режим; реализуется, когда точка пересечения изоклин (линии и аттрактора на рис. 7.2) лежит на падающей ветви. Предельный цикл, сильно релаксационный, изображен на рис. 7.2 жирной линией (пролиферация). Этому режиму естественно сопоставить состояние непрерывной пролиферации при экспоненциальном росте клеток. Быстрые фазы предельного цикла сопровождаются резкими изменениями концентраций радикалов и антиоксидантов. Эти резкие изменения можно рассматривать как сигналы к смене фаз клеточного цикла: перескок при больших сигнал к началу синтеза ДНК (т. е. к переходу и перескок при малых — сигнал к митозу. При этом граница между фазами равно как и граница между митозом и фазой отсутствуют, так как для этих переходов специальные сигналы не требуются.

IV. Триггерный (бистабильный) режим, возникающий в случае, когда изоклина пересекает аттрактор трижды. (Этот случай на рис. 7.2 не показан во избежание загромождения.) Здесь имеется два сравнительно устойчивых состояния, и возможен переброс из одного в другое под действием конечного возмущения. При этом переход сопровождается делением клетки.

Переключение из состояния покоя в пролиферацию может происходить при изменении параметров. Так, увеличение снабжения антиоксидантами (у в уравнении (7.3)), увеличение притока активных липидов и уменьшение притока радикалов способствуют переходу в состояние покоя Отметим, что импульсное, кратковременное, изменение параметров (с возвратом к исходным значениям) может рассматриваться как возмущение (или стимул) к однократному делению. Таким образом, модель (7.3) в целом качественно удовлетворяет требованиям, необходимым для описания клеточного цикла: она содержит два состояния покоя, состояние пролиферации, описывает переход от покоя к пролиферации и однократное деление под воздействием стимулов.

Вместе с тем следует подчеркнуть некоторые особенности модели. Во-первых, система, описываемая (7.3), является недостаточно грубой. Это видно из фазового портрета; изоклина и неустойчивая ветвь аттрактора пересекаются под малым углом и сравнительно небольшое изменение параметров ведет к переключению из в пролиферацию и В реальных системах параметры флуктуируют. Для того чтобы оценить влияние флуктуаций на поведение системы, можно заменить изоклины полосками, ширина которых соответствует амплитуде флуктуаций параметров. Из рис. 7.2 видно, что даже при небольшой ширине коридоров флуктуаций все перечисленные режимы перекрываются. В такой ситуации переходы от одного режима к другому будут происходить под воздействием флуктуаций, т. е. случайно и не контролируемо. Иными словами, модель (7.3) описывает

параметрически неуправляемую систему. Во-вторых, в модели отсутствуют параметры, описывающие состояние клеточной поверхности, т. е. система оказывается не чувствительной к образованию контактов между клетками, наличию твердой подложки и другим физическим (точнее, механическим) воздействиям на мембрану. Можно сказать, что модель (7.3) хорошо описывает свойства опухолевых клеток, но не соответствует поведению нормальных.

Рассмотрим теперь модель с учетом фазовых переходов в мембране. Фазовым переходам в липидном бислое посвящена обширная литература (см. [21]).

Рис. 7.3. Зависимость параметра а (текучести) от состава липидного слоя.

Физические состояния бислоя отличаются степенью упорядоченности углеводородных цепей липидов. В упорядоченном, жидкокристаллическом состоянии цепи распрямлены («all-trans» - структура) и плотно упакованы. Иногда такое состояние условно называют «твердым». Напротив, в «жидком» состоянии в цепях имеются изломы («кинки»), упаковка их более рыхлая и хаотическая. Эти состояния различаются по физическим свойствам: плотности, вязкости и др. Наиболее важную роль играет вязкость, поскольку она влияет на скорость бимолекулярных реакций в мембране, т. е. на коэффициент а в (7.1) и (7.3). Вязкости в «твердом» и «жидком» состояниях могут различаться в несколько раз [211. Фазовые переходы из «твердого» в «жидкое» состояние могут происходить при изменении температуры, давления и состава; для нас наиболее важны два последних фактора, поскольку процесс протекает при постоянной температуре. При увеличении содержания активных липидов происходит переход из «твердого» в «жидкое» состояние, вязкость падает, текучесть возрастает и коэффициент а увеличивается от значения до что схематически изображено на рис. 7.3. При этом возможны два типа фазовых переходов: плавный (рис. 7.3, а) и гистерезисный (рис. 7.3, б). В последнем случае зависимость неоднозначна. Имеются две точки срыва метастабильных состояний: при увеличении 5 переход в «жидкое» состояние происходит при и имеет характер скачка: параметр а быстро и резко увеличивается. Обратный переход происходит при меньшем значении и также имеет резкий характер. В области могут существовать, в зависимости от предыстории, как «жидкое», так и «твердое» состояния. Это означает, что в области

«твердое» состояние является метастабильным и при быстро релаксирует к стабильному с выделением энергии. То же самое можно сказать о «жидком» состоянии в области Рассмотрим теперь модель клеточного цикла с учетом зависимости Видно, что при плавном характере зависимости свойства модели практически не изменяются. Она по-прежнему нечувствительна к внешним механическим воздействиям на клеточную мембрану, недостаточно груба и, таким образом, не описывает регуляцию цикла нормальных клеток.

При гистерезисной зависимости появляется новый внешний фактор — метастабильные состояния типа «переохлажденной жидкости» и (или) «перегретого твердого тела». Известно, что такие состояния чувствительны к внешним, в том числе механическим, воздействиям. Кроме того, сам процесс «разрядки метастабили» является мощным сигналом, более сильным, нежели изменение содержания радикалов и антиоксидантов (которое при этом также имеет место).

Рассмотрим этот вариант более детально. Параметр а в этом случае является новой динамической переменной, для которой можно записать кинетическое уравнение, и вся модель принимает вид

Характерное время установления фазового равновесия та очень мало, тем не менее заменить уравнение (7.4в) алгебраическим нельзя, поскольку многозначная функция и имеет неустойчивую ветвь. Таким образом, модель (7.4), строго говоря, является трехмерной. Она, однако, сильно упрощается, если принять во внимание следующие обстоятельства.

Во-первых, физические свойства (и параметр а) меняются сильно только при переходе от одного состояния к другому и практически постоянны, если фазовое сотояние не меняется. Во-вторых, фазовые изменения происходят только при определенных значениях Это означает, что в трехмерном пространстве переменных все процессы разыгрываются на двух параллельных плоскостях а перескоки изображающей точки происходят перпендикулярно этим плоскостям при достижении значений или Поэтому весь процесс можно представить на плоскости спроектировав на нее движение изображающей точки на двух плоскостях Можно показать, что в данной модели, как и в прежней, возможны четыре режима функционирования. Два стационарных ждущих режима, соответствующих состояниям покоя один автоколебательный режим и один бистационарный — триггерный.

На рис. 7.4, а представлен фазовый портрет ждущего режима Состояние покоя возникает, если пересечение изоклин, соответствующих «твердой» мембране, находится ниже линии Состояние возникает в случае, если точка 1 расположена выше линии а точка 2 — выше линии

Автоколебательный режим возникает, если точка 1 — выше линии и точка 2 — ниже он представлен на рис. Бистабильный режим возникает, если обе точки находятся внутри интервала Переход от одного режима к другому регулируется главным образом параметрами

Рис. 7.4. Проекции фазовых портретов на плоскость Ждущий стационарный режим — состояние Автоколебательное состояние — режим пролиферации.

Из портретов рис. 7.4 видно, что модель (7.4) является более грубой, нежели модель (7.3). Действительно, углы пересечения изоклин достаточно велики и даже с учетом коридора флуктуаций смешение режимов покоя не происходит. Разумеется, в случае, когда стационарная точка близка к линии порог возбуждения уменьшается и становится возможным смешение режимов покоя и пролиферации (за счет флуктуаций параметров). При этом процесс приобретает стохастический характер. В целом эта модель способна описать клеточный цикл нормальных клеток и его регуляторные свойства.

Обсудим теперь физические условия, необходимые для возникновения метастабильных состояний и гистерезиса. Как правило, гистерезис имеет место при фазовых переходах первого рода в однокомпонентных системах, тогда как в двух- (и более) компонентных системах вблизи термодинамического равновесия фазовый переход носит плавный характер, метастабильные состояния не образуются и гистерезис отсутствует. То же относится и к липидной мембране (подробнее см. в [18]). Физический смысл этого прост: при плавном изменении состава сперва образуются малые кластеры новой фазы, которые играют роль «центров кристаллизации», а затем при последующем изменении состава изменяется размер и состав кластеров, пока новая фаза не займет весь объем. Иными словами, в многокомпонентных системах имеется дополнительная (по сравнению с однокомпонентными) степень свободы — состав фазы.

Благодаря этой степени свободы уменьшается активационный барьер образования зародыша новой фазы и метастабильное состояние не возникает.

Гистерезисный переход, однако, становится возможным, если учесть другие (помимо липидного слоя) структуры клеточной мембраны: встроенные белки, внешний слой гликопротеидов и внутренний слой микротрубочек и микрофиламентов. Схематически они изображены на рис. 7.5.

Рис. 7.5. Схема строения клеточной мембраны: Л - липиды, Б - белки, МФ - микрофиламенты, МТ - микротрубочки, ГЛ - гликолипиды, ГП - гликопротеины, ГАГ - глюкозамингликоны.

Вопрос о кооперативных процессах в этих структурах и их возможной роли имеет свою историю. Впервые на это обратил внимание Шанже (см. [22]), затем эти идеи были развиты и детально обсуждены в монографии [23]. В работе Бланкета [24] рассмотрен «фазовый переход» в системе встроенных белков. Принято, что белки могут находиться в двух состояниях, и взаимодействовать друг с другом. При этом переходы могут носить кооперативный характер, что продемонстрировано в [24] с помощью модели Изинга. Подчеркнем, кооперативность — наиболее важное свойство модели. Для ее реализации необходима сплошная (или целостная) система белков; в противном случае взаимодействие между белками ослабевает и «фазовый переход» становится не кооперативным. Для сопряжения с клеточным циклом предполагается, что после митоза в мембране реализуется состояние А. Переход в другое состояние может осуществляться при сильном внешнем воздействии (например, факторов роста или иных стимуляторов), оно же является сигналом к переходу в -фазу (синтез ДНК). В расчетах система встроенных белков фигурирует как однокомпонентная. Тем не менее вопрос о возникновении метастабильных состояний при этом не обсуждается, в связи с чем и возникает необходимость сильного внешнего стимула.

На важную роль метастабильных состояний мембраны в клеточном цикле четко указали Конев и Мажуль [14]. Фазовые переходы из метастабильного состояния в стабильное обязательно носят кооперативный характер, но, кроме того, они обеспечивают усиление сигнала. Действительно, при этом внешнее воздействие может быть слабым, но усиливается благодаря разрядке энергии метастабили. Для осуществления долгоживущих метастабильных состояний также необходима целостность надмембранных структур — это важное свойство является общим во всех упомянутых подходах.

Рис. 7.6. Схема возникновения исрыва метастабильного состояния.

Обсудим вопрос о метастабильных состояниях мембраны более детально, учитывая свойство соединенной с липидным слоем механической подсистемы. Схематически такая ситуация изображена на рис. 7.6. Механический каркас, соединенный с липидным слоем, сдерживает переход и способствует образованию метастабильного состояния (при увеличении концентрации активных липидов рост объема липидного слоя сдерживается каркасом). В слое возникает давление, растягивающее каркас (рис. 7.6, а). При высоком давлении фазовый переход в жидкое состояние не происходит до тех пор, пока сила растяжения не превысит предела прочности каркаса. В этот момент каркас ломается, давление падает и весь липидный слой сразу переходит в жидкое состояние (рис. 7.6, б). Величина (см. рис. 7.4) является концентрацией активных липидов, при которой внутреннее давление равно пределу прочности каркаса, т. е. зависит не только от свойств липидного слоя, но и от прочности и упругости каркаса. После фазового перехода каркас репарируется и размеры его увеличиваются. При обратном изменении концентрации активных липидов процесс повторяется с той разницей, что каркас работает на сжатие, а не на растяжение.

В нормальной клетке роль каркаса могут выполнять две мембранные подсистемы: внешний скелет, состоящий из гликолипидов, гликопротеинов и протеогликанов, и внутренний скелет — из микротрубочек и микрофиламентов (см. рис. 7.5). Для выполнения регуляторной роли оба скелета должны составлять механически целостную систему. Обломки каркаса, плавающие в мембране, не могут обеспечить образование метастабили.

В реальной клетке ситуация несколько сложнее. Во-первых, все мембранные структуры, включая элементы скелета, непрерывно обновляются. Это возможно без нарушения механической целостности, только если имеются избыточные связи, разрыв и репарация которых не влияют существенно на механические свойства каркаса. Во-вторых, мембрана реальных клеток, как правило,

образует складки. Для того чтобы произошла поломка каркаса, являющаяся сигналом к переходу необходимо, чтобы складки предварительно были растянуты.

Из изложенного видно, что «каркасная» модель (7.4) способна описать основные регуляторные свойства деления нормальной клетки, как то: необходимость распластывания, контактное торможение и роль стимуляторов, действующих на клеточную поверхность.

Обсудим теперь важный и общий для моделей (7.3) и (7.4) вопрос о стохастических свойствах клеточного цикла. Их появление в динамической системе всегда связано с потерей устойчивости или (что то же) с близостью к точке бифуркации. Стохастический режим может возникнуть спонтанно (т. е. в результате бесконечно малых флуктуаций) в системах со «странным аттрактором» (см. гл. 9, 10,42). В релаксационных моделях клеточного цикла странный аттрактор отсутствует. Однако при учете конечных флуктуаций (как динамических переменных, так и параметров) в этих моделях возможен почти стохастический режим. Мы имеем в виду случаи, когда малые, но конечные возмущения существенно усиливаются системой и в результате возникают большие флуктуации периода. В моделях клеточного цикла это имеет место в случае, когда стационарная точка близка к экстремуму аттрактора-. На это обстоятельство впервые было обращено внимание в работе [25]. Расчетами на ЭВМ на примере модели Селькова было продемонстрировано, что внешний «шум» может приводить к естественным флуктуациям периода.

Флуктуации в моделях (7.3) и (7.4) исследовались как аналитически, так и на ЭВМ в работе [26]. Стандартный прием аналитического исследования основан на методе Ланжевена. В правые части уравнений добавляются случайные функции времени с малой амплитудой, коротким интервалом корреляции и нормальным распределением (так называемый «шум динамических переменных»). Под влиянием шума изображающая точка совершает броуновское движение вдоль устойчивой ветви аттрактора. Вычисляются времена достижения точки срыва (т. е. экстремума аттрактора) и функция плотности распределения по этим временам. (Эта функция подчиняется уравнению типа Фоккера—Планка.) Этот метод широко используется в статистической физике; он применим как в случае, когда стационарное состояние устойчиво, но близко к точке срыва (ждущий режим), так и в случае автоколебательного режима, если изображающая точка движется по устойчивой ветви аттрактора достаточно медленно (см., например, [П47]).

Полученные таким образом распределения длительностей клеточного цикла приведены на рис. 7.7. Видно, что при приближении к точке бифуркации распределение становится все более отличным от нормального и дисперсия его сильно увеличивается. При этом в распределении появляется «хвост» длинных периодов, связанный с тем, что часть клеток оказывается в ждущем режиме (состояния покоя или в зависимости от того, к которому из них ближе

стационарная точка). Длительность соответствующей фазы сильно флуктуирует, что и дает главный вклад в дисперсию периода.

Основной вывод из изложенного заключается в следующем. Наблюдаемая на опыте стохастичность длительности фаз клеточного цикла появляется в результате того, что реальные клетки живут поработают в режиме, близком к бифуркационному.

Рис. 7.7. Распределение клеток по длительностям периода (в усл. ед.) с учетом флуктуаций: а) в режиме пролиферации вдали от точек бифуркации; б) по мере приближения к точке бифуркации; в) вблизи точки бифуркации в стационарном режиме.

Такой режим, по-видимому, выгоден, поскольку при этом возможна быстрая адаптация к новым условиям (т. е. быстрая реакция на их изменения).

Сформулируем кратко основные выводы модели.

Первый — необходимость быстрых автокаталитических процессов внутри мембраны. Выше в качестве такового рассмотрено свободно-радикальное окисление липидов; нам сейчас этот процесс представляется наиболее привлекательным и исследованным. Не исключены, однако, и другие возможности. Подчеркнем, что при этом структура модели (топология фазового портрета) и основные качественные выводы из нее сохраняют свою силу.

Второй вывод — наличие механического целостного «скелета» у нормальных клеток и отсутствие такового у злокачественных. Этот вывод независим от первого, он возникает из необходимости усиления внешнего сигнала и остается в силе, даже если не ставить перед собой задачу построения замкнутой модели клеточного цикла.

При сопоставлении с экспериментом именно этот вывод оказывается наиболее плодотворным.