Фосфопротеиды

Общие сведения.

В состав фосфопротеидов входит фосфорная кислота (0,40-0,88%), соединенная эфирной связью с оксиаминокислотами (серином, треонином).

К фосфопротеидам относятся многие весьма важные по своей биологической роли белки: казеиноген (казеин) молока, белки яичных желтков — вителлин, вителленин и витин, белки икры, ферменты — пепсин, фосфорилаза, фосфоглюкомутаза и др.

Фосфопротеиды выпадают в осадок при подкислении раствора, в воде нерастворимы, но растворяются в разбавленных щелочах.

Выделение казеиногена из молока и исследование его свойств.

Казеиноген — важнейший белок молока. Остатки фосфорной кислоты в молекуле казеиногена связаны с остатками серина. В молоке казеиноген находится в виде растворимых в воде анионов кальцината. При подкислении до pH 4,7 (изоэлектрическая точка казеиногена) белок выпадает в осадок. Добавление избытка кислоты вызывает перезарядку белковых молекул и переход их снова в раствор.

Казеиноген высаливается нейтральными солями (хлористым натрием, сернокислым аммонием и др.).

Под действием пищеварительных ферментов (пепсина, химозина) казеиноген превращается в казеин, кальциевая соль которого в отличие от казеиногена нерастворима в воде.

Реактивы: а) молоко, цельное или (лучше) снятое; б) уксусная или молочная кислота, 10%-ный раствор; в) едкий натр, 1%-ный раствор.

В пробирку пипеткой вносят 2 мл молока, прибавляют столько же дистиллированной воды и по каплям — 10%-ный раствор уксусной или молочной кислоты до выпадения осадка (избегать избытка кислоты!). Осадок отфильтровывают на бумажном фильтре и несколько раз промывают дистиллированной водой (на фильтре), после чего растворяют в 1 %.-ном растворе едкого натра. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, смоченный водой. С фильтратом производят цветные реакции на белки и отдельные аминокислоты (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, Адамкевича, Шульце — Распайля, Миллона и др.).

Получение препарата казеиногена (по Д. Л. Фердману и Е. Ф. Сопину, с изменениями).

Реактивы: а) молоко (снятое); б) соляная кислота, 0,5 н раствор; в) диэтиловый эфир. Препарат используют для аналитических работ.

К 1,4 л снятого молока медленно, в течение 25— 30 мин., добавляют 0,5 н раствор соляной кислоты до достижения pH 4,7-4,8 (расходуют приблизительно 145— 150 мл). Содержимое сосуда перемешивают 10 мин., затем оставляют на 1 ч для отстаивания осадка. Жидкость над осадком отсасывают с помощью сифона. В воронку Бюхнера кладут два слоя фильтровальной бумаги. Отфильтровывают осадок, потом его промывают дистиллированной водой 15—20 раз, расходуя на каждое промывание 100-150 мл воды. Для очистки от примеси молочного жира промытый осадок обрабатывают 3—4 раза диэтиловым эфиром, которого берут каждый раз по 80- 100 мл (при этом надо выключить все нагревательные приборы!), после чего распределяют тонким слоем на стекле для удаления остатков эфира и оставляют на 3—4 часа. Выход препарата — 30—35 г.

Гидролиз казеиногена и открытие в нем фосфорной кислоты.

Реактивы: а) препарат казеиногена (см. предыдущую работу); б) едкий натр, 5%-ный раствор, в) азотная кислота, концентрированная-, г) молибденовый реактив (приготовление — см. «Гидролиз нуклеопротеидов»).

0,25 г препарата казеиногена гидролизуют с 5%-ным раствором едкого натра в колбе, закрытой пробкой с воздушным холодильником. Раствора щелочи берут 15 — 20 мл.

Колбу устанавливают на асбестовую сетку и нагревают на небольшом огне до кипения. Кипение поддерживают в течение часа, после чего колбу снимают с нагревательного прибора, дают ей остыть на воздухе и жидкость нейтрализуют концентрированной азотной кислотой, добавляя ее по каплям до слабокислой реакции (по лакмусу) При добавлении кислоты выпадает осадок пептонов, который отфильтровывают на бумажном фильтре. С частью фильтрата (1-2 мл) производят реакцию на фосфорную кислоту с молибденовым реактивом (см. с. 56).