ФОСФАТИДЫ, ИЛИ ФОСФОЛИПИДЫ

Общие сведения.

Одной из наиболее распространенных групп жироподобных веществ, или липоидов, являются фосфолипиды, или фосфатиды. Различают три группы фосфолипидов: а) фосфоглицериды, в состав которых входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота и азотистые основания (холин, коламин, оксиаминокислота серии); б) инозитфосфатады (фосфатиди-линозитиды), содержащие вместо азотистого основания циклический шестиатомный спирт инозит; в) сфингомиэлины (сфингофосфолипиды), молекулы которых состоят из высокомолекулярного двухатомного ненасыщенного аминоспирта сфингозина, остатков жирной и фосфорной кислот и азотистого основания холина. В молекулах сфингомиэлинов жирная кислота соединена пептидной связью с аминогруппой сфингозина.

Выделение лецитинов из желтка куриного яйца.

Понятие о лецитинах. Лецитины относятся к фосфоглицеридам (фосфатидилхолинам). При гидролизе лецитинов освобождается молекула глицерина, две молекулы жирных кислот (из которых одна является непредельной), молекулы фосфорной кислоты и азотистого основания холина.

Фосфорная кислота в молекуле лецитина соединена сложноэфирной связью со спиртовой группой холина

В зависимости от того, к какому углеродному атому глицерина присоединен остаток холинфосфорной кислоты, выделяют а- и -лецитины. Лецитины различаются также по жирным кислотам, входящим в их состав

Реактивы: а) желток куриного яйца; б) этиловый спирт; в) ацетон; г) хлористый кадмий, насыщенный спиртовой раствор.

В небольшой стаканчик вносят около желтка куриного яйца и, помешивая стеклянной палочкой, добавляют 10 мл горячего спирта. После остывания содержимое стаканчика фильтруют в сухую пробирку. Фильтрат должен быть прозрачным. Если в нем появляется муть, фильтрование повторяют до получения прозрачного фильтрата.

Со спиртовым раствором лецитинов проделывают ряд реакций.

Осаждение ацетоном. В сухую пробирку наливают 2-3 мл ацетона и по каплям прибавляют спиртовой раствор лецитинов. Выпадает осадок, так как лецитины в ацетоне не растворяются.

Получение эмульсии лецитинов. Для получения эмульсии к 2-3 мл спиртового раствора лецитинов добавляют (по каплям) дистиллированную воду. Образуется устойчивая эмульсия лецитинов в воде.

Осаждение хлористым кадмием. В сухой пробирке к 1 мл спиртового раствора лецитинов добавляют по каплям насыщенный раствор хлористого кадмия. Выпадает белый осадок соединения лецитинов с хлористым кадмием.

Гидролиз лецитинов и исследование их состава. Реактивы: а) спиртовой раствор лецитинов (см. выше); б) едкое кали или едкий натр,

10%-ный раствор; в) хлорная платина, 10%-ный спиртовой раствор; г) кислый сернокислый калий или натрий или кристаллический, или борная кислота кристаллическая; д) ацетон; е) азотнокислый калий (KNO3), кристаллический; ж) углекислый натрий кристаллический; з) азотная кислота, концентрированная; и) молибденовый реактив (см. «Гидролиз нуклеопротеидов»).

К спиртовому раствору лецитинов прибавляют ацетон до выпадения осадка, с которым производят дальнейшие реакции. Для выполнения работы можно также использовать фармацевтический препарат «лецитин-церебро» в драже (перед проведением реакций драже очищают от оболочки).

Часть осадка лецитинов нагревают с несколькими миллилитрами 10%-ного раствора едкого натра или едкого кали. Лецитины гидролизуются на свои компоненты. При гидролизе происходит частичный распад холина с отщеплением триметиламина, обладающего селедочным запахом.

С гидролизатом производят реакции на жирные кислоты, холин, глицерин и фосфат-ион.

Проба на жирные кислоты. К части гидролизата добавляют по каплям 10%-ный раствор серной кислоты — выделяются свободные жирные кислоты. Содержимое пробирки фильтруют через бумажный фильтр, на котором задерживаются жирные кислоты.

К фильтрату прибавляют раствор едкого кали или едкого натра до нейтральной реакции на лакмус, после чего выпаривают досуха на водяной бане. Сухой остаток делят на три части.

Проба на глицерин. Часть сухого остатка сплавляют с порошком кислого сернокислого калия или натрия, или борной кислоты. Образуется акролеин, который обнаруживается по резкому специфическому запаху.

Проба на холин. Кроме образования триметиламина (см. выше), наличие холина определяют с помощью реакции с хлорной платиной. Другую часть сухого остатка растворяют в этиловом спирте и к раствору добавляют по каплям 10%-ный спиртовый раствор хлорной платины. Выпадает осадок хлороплатината холина. Осадок отделяют фильтрованием, растворяют его в нескольких каплях горячей воды. При медленном охлаждении

раствора выделяются кристаллы хлороплатината холина оранжево-красного цвета.

Проба на фосфат-ион. Часть сухого остатка переносят в небольшой тигель, прибавляют немного азотнокислого калия и углекислого натрия в порошке, перемешивают с сухим остатком и сплавляют на небольшом огне. Сплав растворяют в 2 мл азотной кислоты, растирая палочкой. К раствору добавляют 2 мл молибденового реактива и нагревают. Выпадет желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии

(по прописи М. И. Прохоровой и 3. Н. Тупиковой). В последние годы широкое распространение получил метод распределительной хроматографии в тонком слое адсорбента на стеклянных пластинках, названный тонкослойной хроматографией. Этот метод, предложенный советскими исследователями Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбером в 1938 г., отличается быстротой выполнения и простотой, не требует сложной аппаратуры.

Применяют два варианта метода: с закрепленным (с помощью фиксатора) и незакрепленным слоем адсорбента на пластинке. Адсорбентом служит силикагель отечественного производства (марки КСК), к которому в качестве фиксатора добавляют медицинский гипс, рисовый или маисовый крахмал и воду.

Для качественного разделения фосфолипидов применяют стекло с гладкой поверхностью (зеркальное; стекла от фотопластинок; предметные). Размеры стекол: 3X9 см или 4x18 см.

Готовят смесь силикагеля с гипсом и водой. На пластинки берут мг силикагеля, 1-1,2 мг гипса и 0,03-0,04 мл воды. Силикагель измельчают на шаровой мельнице и просеивают через сито с отверстиями в 60 мкм. К адсорбенту добавляют также раствор родамина с которым фосфолипиды образуют комплексные соединения, флуоресцирующие в ультрафиолетовых лучах. К воды прибавляют 0,0011 г родамина

Силикагель, гипс и воду (в указанных соотношениях) тщательно смешивают в ступке (лучше агатовой) и однородную массу шпателем наносят на стеклянные пластинки, следя, чтобы слой адсорбента был равномерным, без пузырьков. Пластинки оставляют (в строго горизонтальном положении) на воздухе (при 20-28°С) на 20 —

25 мин., после чего для активирования адсорбента нагревают при 105° С в течение 30 мин. или при мин.

Хроматографическая камера представляет собой стеклянный сосуд любой формы (удобнее всего — четырехугольный) с плоским дном и пришлифованной крышкой.

Фосфолипиды растворяют в смеси хлороформа с бутиловым спиртом (2 : 1). На расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки намечают стартовую линию, на которую с помощью микропипетки (объемом 0,1 мл) или капилляра наносят раствор липидов в виде точек, отстоящих друг от друга на 1 см. Раствор наносят осторожно, стараясь не нарушить слоя адсорбента. Лучшие результаты получаются, если нанести на пластинку не более 1 мг фосфолипидов.

Пластинку ставят в вертикальном положении. На дно камеры наливают растворитель в таком количестве, чтобы нижний край пластинки был погружен в жидкость на 5 мм.

При тонкослойной хроматографии фосфолипидов чаще всего употребляют следующие растворители: а) хлороформ— метиловый спирт аммиак (60:35:5 по объему); б) хлороформ — метиловый спирт — уксусная кислота — вода (50 : 25 : 8 : 4); в) хлороформ — метиловый спирт — вода (65:25:4). Для насыщения воздуха камеры парами растворителя внутри сосуда укрепляют куски фильтровальной бумаги, смоченной растворителем. Камеру закрывают пришлифованной крышкой (в роли крышки может выступать хорошо пришлифованная к стенкам стеклянная пластинка). Разделение фосфолипидов производят до тех пор, пока жидкость не поднимется на высоту 7—8 см (на пластинках 3x9 см) или 10—12 см (на пластинках 4X18 см). Обычно оно продолжается около 20—25 мин. По истечении указанного времени пластинку вынимают из камеры и просматривают в ультрафиолетовых лучах (в ультрахимископе): фосфолипиды, содержащие серии и инозит, проявляются в виде пятен лилового или синего цвета; пятна фосфатидов, в состав молекул которых входят холин и этаноламин (коламин), дают желтую или желто-оранжевую флуоресценцию.

Если при формировании массы адсорбента не был добавлен родамин то еще влажные пластинки, вынутые из камеры, можно опрыскивать 0,03%-ным раствором

родамина или родамина В в -ном этиловом спирте и просматривать в ультрафиолете.

Кроме родамина, применяют также следующие проявители:

а) Пары иода. Высушенную при комнатной температуре пластинку помещают на 1 мин. в герметически закрываемый сосуд с парами иода.

б) Железо-сульфосалициловый реактив. В 25 мл воды растворяют 7 г сульфосалициловой кислоты и 0,1 г хлорного железа, после чего раствор доливают до 100 мл 95%-ным этиловым спиртом. Он является реагентом на фосфатные группы.

в) Молибденовую кислоту. 3 г молибденовокислого аммония; растворяют в 50 мл воды, добавляют н соляной кислоты и 13 мл 70%-ной перхлорной кислоты.

Пластинки, вынутые из камеры, высушивают при комнатной температуре, опрыскивают раствором проявителя и прогревают 10 мин. при 80° С. Фосфатиды проявляются в виде синих или серовато-синих пятен.

Пользуются также частными проявителями, с помощью которых можно обнаружить отдельные компоненты молекулы фосфолипидов.

а) Раствор нингидрина. Сухие пластинки опрыскивают раствором нингидрина (приготовление см. с. 8) и высушивают при комнатной температуре. На белом фоне пластинки появляются красные или красно-фиолетовые пятна, обусловленные свободными аминогруппами.

б) Аммиачный раствор окиси серебра. Сухие пластинки опрыскивают аммиачным раствором окиси серебра (см. работу «Гидролиз нуклеопротеидов») и прогревают при 110° С до появления коричневых пятен, обусловленных глицерином и инозитом.

в) Реактив Драгендорфа (см. работу «Осаждение белков реактивами на алкалоиды»). Сухие пластинки опрыскивают реактивом Драгендорфа и высушивают при комнатной температуре. Появляются пурпурные или оранжевые пятна холина и холинсодержащих соединений.

г) Реактив Шиффа. Для проявления фосфолипидов реактив готовят по следующей прописи: 4 г основного фуксина растворяют в 17 мл горячей воды (90—95° С), добавляют воду до 1 л и перемешивают до тех пор, пока температура раствора не снизится до 40°. После этого добавляют 8 г пиросернистокислого калия (пиросульфита)

та) концентрированной соляной кислоты и оставляют стоять 16-18 ч, затем к раствору прибавляют 2 г активированного угля, перемешивают и фильтруют на воронке Бюхнера. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным. Хранят в холодильнике (до 1 месяца). Для проявления фосфолипидов смешивают 1 мл реактива Шиффа, 1 мл 0,05 М раствора двухлорной ртути (сулемы) и 10 мл 0,05 М раствора серной кислоты, после чего доводят водой до 100 мл.

Сухие пластинки опрыскивают проявляющим раствором: на бледно-фиолетовом фоне появляются фиолетовые пятна. Проявитель реагирует со всеми фосфолипидами.

Рассчитывают значение для каждой фракции фосфолипидов сравнивая их со следующими данными (по А. А. Липской):