ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (ГИДРОЛАЗ)

Определение активности амилазы слюны (по Вольгемуту).

Определяют предельное разведение фермента, при котором наблюдается полное расщепление крахмала. Метод находит применение в клинической лабораторной практике.

Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз; б) раствор Люголя (см. с. 114); в) крахмал, 0,1%-ный раствор, свежеприготовленный.

Нумеруют 10 пробирок. В каждую из них наливают из пипетки по 1 мл дистиллированной воды. В первую пипеткой вносят 1 мл разведенной слюны. Содержимое пробирки перемешивают, три раза втягивая в пипетку и выпуская. 1 мл раствора из первой пробирки переносят во вторую, повторяют те же операции, затем 1 мл раствора из второй пробирки переносят в третью и т. д. Таким образом, концентрация амилазы в каждой из пробирок в два раза ниже, чем в предыдущей. Из десятой пробирки 1 мл раствора выливают.

Во все пробирки добавляют еще по 1 мл дистиллированной воды и, начиная с десятой, — по 2 мл раствора крахмала, перемешивая при этом содержимое каждой пробирки. Все 10 пробирок одновременно ставят на 30 мин. в водяную баню, нагретую до 37-38 ° С (внимательно следят за температурой, не допуская ее повышения).

Через 30 мин. пробирки охлаждают под краном и в каждую из них прибавляют по 2 капли раствора Люголя. Наблюдают окрашивание жидкости. При полном расщеплении крахмала амилазой жидкость в пробирке будет бесцветной или слабо желтоватой, если расщепления не произошло — жидкость окрашена в синий цвет. В промежуточных пробирках наблюдается гамма переходных оттенков цвета — от синевато-фиолетового до буроватожелтого. Результаты опыта записывают по образцу табл. 5.

Для расчета количества амилазы в слюне учитывают ту пробирку, в которой уже нет синего оттенка (т. е. ту, после которой жидкость во всех остальных пробирках окрашена в синий цвет). Пусть это будет, например, четвертая. В четвертой пробирке неразведенной слюны содержится

Табл. 5. Исследование активности амилазы

Это количество слюны расщепляет 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной слюны способен расщепить 320 мл 0,1%-ного раствора крахмала . Активность амилазы слюны (амилокластическую силу) выражают количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, который способен расщепить 1 мл неразведенной слюны в течение 30 мин. при 37—38° С. Амилокластическая сила слюны человека составляет в норме 260—320 ед.

Определение активности липазы.

Липазы катализируют реакцию гидролитического расщепления сложноэфирных связей в молекулах жира, в результате которой освобождаются глицерин и жирные кислоты:

Гидролитическую активность липазы можно определить с помощью различных методов: титриметрического, сталагмометрического, колориметрического и ряда других.

Реактивы: а) растительное масло; б) препарат липазы: 10—12 г семян льна, конопли, пшеницы тщательно растирают с кварцевым песком до образования гомогенной массы, которую обрабатывают в ступке пятикратным количеством ацетона в течение 10 мин., растирая пестиком. Кашицеобразную массу центрифугируют. Остаток два раза обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего высушивают над серной кислотой в вакуум-эксикаторе в течение 12 ч и растирают в ступке. Перед опытом ферментный препарат растирают с водой в отношении 1 : 10. Для анализа берут 0,1-0,5 мл суспензии; в) едкое кали, 0,1 н раствор; г) ацетатный буфер, pH 4,7. Смешивают равные объемы нормальных растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия (оптимум действия большинства растительных липаз лежит при pH 4,6-4,9); д) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (1:1) (готовится перед употреблением); е) фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

В коническую колбу на 50 мл отвешивают на техно-химических весах 2,0-2,5 г растительного масла, к навеске добавляют 2 мл ацетатной буферной смеси, тщательно встряхивают и приливают 0,1-0,5 мл суспензии ферментного препарата, смешанной с 3 мл воды. Смесь в колбе доливают водой до общего объема 8 мл, энергично встряхивают и переносят в аппарат для взбалтывания. Колбу закрывают пробкой и взбалтывают в течение 1 ч при температуре 20° С, затем ее содержимое (с помощью 60 мл нейтрализованной спирто-эфирной смеси) количественно переносят в сухую коническую колбу большего объема. Свободные жирные кислоты, образовавшиеся при гидролитическом расщеплении масла, оттитровывают 0,1 н раствором едкого кали (индикатор — раствор фенолфталеина). Одновременно проводят контрольный опыт с прокипяченной суспензией ферментного препарата.

Активность липазы х выражают количеством миллилитров 0,1 н раствора щелочи, израсходованных для нейтрализации свободных жирных кислот, образующихся при гидролитическом расщеплении 1 г масла:

где a — количество 0,1 и раствора едкого кали, израсходованное на титрование опытного образца, мл; b — то же для контрольного образца; k — поправочный коэффициент 0,1 н раствора едкого кали; н — навеска масла, г.