Раздел V. ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ, ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА АЗОТА

Среднее содержание азота в белках составляет Для пересчета общего количества азота на белок нужно найденное количество общего азота умножить на коэффициент 6,25. При исследовании зерна и продуктов его переработки принят пересчетный коэффициент 5,70, молока и молочных продуктов — 6,38.

При определении содержания общего азота в биологическом материале получают величину, которая характеризует общее количество азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот, амидов, аминокислот, креатинина, креатина, мочевой кислоты, аммонийных солей, аммиака, солей азотной и азотистой кислот и др.) в исследуемом объекте. Умножая ее на пересчетный коэффициент, получают представление о содержании не чистого белка в продукте, а так называемого «сырого протеина», поэтому при более точных исследованиях наряду с определением количества общего азота следует также изучить содержание белкового азота, азота аминокислот и амидов и т. д.

Для определения общего азота продукт минерализуют нагреванием с концентрированной серной кислотой при участии катализаторов (сернокислой меди, ртути, селена и др.) и окислителей (пергидроля, марганцовокислого калия). При этом углерод и водород окисляются до двуокиси углерода и воды, а азот отщепляется в виде аммиака

Аммиак далее реагирует с серной кислотой

Аммонийные соли (или аммиак) взаимодействуют с реактивом Несслера, образуя иодид меркураммония, окрашенный в желто-бурый цвет.

Интенсивность окраски пропорциональна содержанию аммиака в растворе, что позволяет применить эту реакцию для количественного определения содержания общего азота в биологическом материале.

Реактивы: а) реактив Несслера (двойная соль иодистой ртути и иодистого калия в растворе едкого кали или натра). Используется готовый или приготавливается лаборантом по такой прописи: в 20 мл воды растворяют 10 г двуиодистой ртути и 8 г иодистого калия. Образуется комплексное соединение. В 80 мл воды отдельно растворяют 20 г едкого натра. Оба раствора после остывания сливают в один сосуд и фильтруют через стеклянную вату-, б) серная кислота, концентрированная в) пергидроль; г) едкий натр, 0,25 н раствор; д) стандартный раствор: навеску 0,7643 г химически чистого хлористого аммония или 0,9429 г химически чистого сернокислого аммония вносят в мерную колбу на 1 л, растворяют в 20-30 мл дистиллированной воды, свободной от аммиака, и той же водой доводят до метки. Получают так называемый основной раствор. 10 мл основного раствора пипеткой вливают в литровую мерную колбу и доводят до метки дистиллированной водой, свободной от аммиака. Получают рабочий стандартный раствор, 1 мл которого соответствует 0,002 мг азота; е) дистиллированная вода, освобожденная от аммиака: дистиллированную воду слабо подкисляют серной кислотой и вторично перегоняют, отбрасывая первую и последнюю порции.

Продукт, подлежащий исследованию, тщательно, измельчают. Навеску измельченного продукта в 0,03-0,08 г вносят в пробирку из термоустойчивого стекла (диаметром 15 мм), куда добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и 1—2 капли пергидроля. Удерживая в

наклонном положении (с помощью держателя), пробирку нагревают на слабом огне. В течение 2—3 мин. обычно происходит обесцвечивание жидкости. При дальнейшем нагревании бесцветная и прозрачная жидкость не должна желтеть. Если же она принимает желтое окрашивание, то это свидетельствует о неполном сожжении органических веществ. В этом случае содержимое пробирки охлаждают, добавляют еще 1—2 капли пергидроля и снова нагревают на медленном огне. Всего расходуют не более 4—5 капель пергидроля.

При минерализации органических веществ избегают бурного кипения жидкости.

После того как все органические вещества окислились, на что указывает устойчивое обесцвечивание жидкости, содержимое пробирки количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, на дно которой заранее наливают 10-15 мл воды, освобожденной от аммиака. После охлаждения мерную колбу доводят до метки той же водой.

Пипеткой отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и оттитровывают 0,25 н раствором едкого натра до появления устойчивого слаборозового окрашивания. Затем той же пипеткой снова отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, вносят в другую мерную колбу на 100 мл и добавляют столько же 0,25 н раствора едкого натра, сколько было израсходовано на нейтрализацию кислоты при предварительном титровании (фенолфталеин не прибавляют), после чего раствор в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают. Раствор используется для определения содержания общего азота.

Берут две мерные колбы на 100 мл. В одну из них пипеткой вносят 10 мл испытуемого раствора, в другую — 10 мл рабочего стандартного раствора. В обе колбы приливают по 50 мл воды, 4 мл реактива Несслера, доводят водой до метки и перемешивают.

Интенсивность окраски обоих растворов уравнивают в колориметре или другого типа, фотометре ФМ-58 или

Расчет производится следующим образом. Навеска продукта 0,05 г. После сжигания раствор доводится до 100 мл, 10 мл полученного раствора после нейтрализации вновь разводится до объема 100 мл.

К 10 мл указанного раствора было добавлено 4 мл реактива Несслера и воды до объема 100 мл. В другую мерную колбу внесли 10 мл рабочего стандартного раствора (1 мл которого содержит 0,002 мг азота) и также прибавили 4 мл реактива Несслера и воды до общего объема 100 мл.

При уравнивании интенсивности окрасок испытуемого и стандартного раствора в колориметре высота столба стандартного раствора составила 25 мм, испытуемого — 20 мм.

Общее количество азота в продукте следующее:

Содержание «сырого протеина»