ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ДИСАХАРИДОВ

Строение дисахаридов.

Молекулы дисахаридов состоят из остатков двух молекул моносахаридов, соединенных гликозидной связью. К дисахаридам относятся: сахароза (свекловичный или тростниковый сахар), мальтоза (солодовый сахар), лактоза (молочный сахар), трегалоза (грибной сахар, микоза), целлобиоза (дисахарид, освобождающийся при гидролитическом расщеплении клетчатки), генцйобиоза и др.

По типу связи между молекулами моноз дисахариды можно разделить на две группы: 1) построенные по типу мальтозы; 2) типа трегалозы.

Дисахариды мальтозного типа состоят из двух остатков моноз, соединенных в положении 1,4, т. е. кислородный мостик связывает первый атом углерода одной молекулы моносахарида с четвертым атомом углерода другой.

У мальтозы остается свободным один гликозидный гидроксил (карбонильная группа), поэтому дисахариды, построенные по типу мальтозы, сохраняют все реакции, свойственные карбонильной группе (Троммера, Бенедикта, Ниландера, с фелинговой жидкостью и т. д.).

По мальтозному тйпу построены также лактоза и целлобиоза. При гидролизе лактозы освобождаются молекула а-глюкозы и молекула галактозы

Молекула целлобиозы гидролитически расщепляется на две молекулы -глюкозы. Следовательно, целлобиоза-р-глюкозид-1,4-глюкоза.

В молекулах дисахаридов, построенных по типу трегалозы, моносахариды соединены кислородным мостиком между двумя гликозидными гидроксилами (карбонильными группами). Поэтому дисахариды трегалозного типа лишены восстанавливающих свойств. К дисахаридам указанного типа относятся сахароза и трегалоза. Сахароза легко гидролизуется с образованием смеси равных количеств глюкозы и фруктозы, называемой инвертным сахаром. Инвертный сахар дает все реакции, характерные для моноз

Трегалоза состоит из остатков двух молекул а-глюкозы, соединенных в положении 1,1, т. е. кислородный мостик связывает оба гликозидных гидроксила. Трегалоза также не обладает восстанавливающими свойствами.

Исследование восстанавливающих свойств дисахаридов.

Реактивы: а) мальтоза, раствор: б) лактоза, -ный раствор; в) сахароза, -ный раствор; г) реактивы Бенедикта, Ниландера, фелингова жидкость; реактивы для реакции Троммера.

В пробирки вносят по 3-4 мл растворов мальтозы, лактозы, сахарозы и производят с ними реакции Бенедикта, Ниландера, Троммера, с фелинговой жидкостью. Мальтоза и лактоза обладают восстанавливающими свойствами, сахароза, как уже было указано, лишена этой способности.

Инверсия сахарозы. Реактивы: а) сахароза, -ный раствор; б) соляная кислота, концентрированная; в) едкий натр, -ный раствор; г) реактивы для реакций Троммера, Бенедикта, Ниландера, Селиванова.

В пробирку наливают 3-4 мл раствора сахарозы, добавляют 2—3 капли соляной кислоты и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10—15 мин., после чего содержимое пробирки охлаждают и нейтрализуют раствором едкого натра (под контролем лакмусовой бумажки). С нейтрализованной пробой (инвертом) производят реакции Троммера, Ниландера или Бенедикта. Продукты инверсии сахарозы — глюкоза и фруктоза — обладают восстанавливающими свойствами. С частью инверта проделывают реакцию Селиванова на фруктозу.

Реакция сахарозы с солями кобальта.

Сахароза в щелочной среде дает фиолетовое окрашивание с ионом

Реактивы: а) сахароза, -ный раствор; б) азотнокислый или сернокислый кобальт, -ный раствор; в) едкий натр или едкое кали, -ный раствор.

К 2 мл раствора сахарозы добавляют 1 мл раствора щелочи и несколько капель раствора соли кобальта. Появляется фиолетовое окрашивание.

Реакция Барфеда (в модификации Таубера — Клейнера).

Реакция Барфеда позволяет быстро отличить моносахариды от дисахаридов мальтозного типа, обладающих, как известно, восстанавливающими свойствами (лактозы, мальтозы, целлобиозы). Она основана на том, что восстанавливающие свойства моносахаридов сохраняются также в кислой среде, тогда как дисахариды восстанавливают металлы только при щелочной реакции. При взаимодействии дисахаридов с реактивом Барфеда

красный осадок закиси меди появляется не сразу, а лишь спустя некоторое время (15—20 мин.), когда произойдет их гидролитический распад, который катализируется кислотами.

Реактивы: а) глюкоза, -ный раствор; б) лактоза или мальтоза, -ный раствор; в) реактив Барфеда (в модификации Таубера и Клейнера): в 450 мл горячей воды растворяют 24 г уксуснокислой меди, прибавляют -ной молочной кислоты и перемешивают до растворения осадка. После охлаждения доливают водой до 500 мл и фильтруют. Реактив Барфеда можно готовить и по следующей прописи: в 200 мл горячей воды растворяют 13,3 г уксуснокислой меди. Помешивают до растворения соли, фильтруют. К фильтрату прибавляют ледяной уксусной кислоты.

В две пробирки наливают по 1 мл реактива Барфеда. В первую пробирку добавляют 1 мл раствора глюкозы, во вторую — столько же раствора лактозы или мальтозы. Пробирки встряхивают и ставят в кипящую водяную баню. В пробирке с глюкозой через 2—3 мин. появляется красный осадок закиси меди, тогда как в пробирке с дисахаридом реакция восстановления наблюдается лишь после 15-20-мииутной выдержки в водяной бане.

Ферментативный гидролиз сахарозы.

Фермент -фруктофуранозидаза (инвертаза, сахараза) катализирует процесс расщепления сахарозы до глюкозы и фруктозы. Он содержится в пекарских дрожжах.

Реактивы: а) пекарские дрожжи (прессованные); б) сахароза, -ный раствор; в) реактив Бенедикта или реактивы для реакции Троммера (см. выше).

1-1,5 г пекарских дрожжей растирают в ступке с 10-12 мл воды до получения однородной взвеси. К 2 мл взвеси прибавляют 2 мл воды и производят реакцию Троммера или Бенедикта (проверка восстанавливающей способности дрожжей).

В две пробирки наливают по 3 мл взвеси дрожжей; одну из них ставят на 10 мин. в кипящую водяную баню (для тепловой инактивации фермента) и потом охлаждают под краном, вторую не нагревают. В обе пробирки добавляют по 3 мл раствора сахарозы и оставляют на 5—8 мин., после чего фильтруют. С фильтратами проделывают реакцию Троммера или Бенедикта. Записывают результаты опыта.

Распределительная хроматография сахаров на бумаге.

Теоретические основы метода и общие положения методики были описаны на с. 27.

Для хроматографического разделения сахаров употребляют бумагу № 1 и 2 Ленинградской фабрики им. Володарского, фабрики «Маяк революции» (I сорт), а также ватман № 1 и 2.

Восходящую хроматографию проводят в цилиндрах с притертыми пробками или больших пробирках (25X ) с подобранными резиновыми пробками. Для круговой хроматографии используют эксикаторы небольшого размера или чашки Петри.

Реактивы: а) стандартные растворы сахаров (глюкозы, мальтозы, фруктозы, лактозы, сахарозы, пентоз): готовят из расчета 10 мг углевода в 1 мл раствора; б) смесь н-бутилового спирта, пиридина и воды в соотношении 6:4:1 (по объему); в) бензидин: 0,5 г препарата растворяют в 20 мл ледяной уксусной кислоты и 80 мл абсолютного этилового спирта; г) флороглюцин: 0,2 г препарата растворяют в 80 мл 90%-ного этилового спирта, доводят до объема -ным раствором трихлоруксусной кислоты; д) динитросалициловая кислота, -ный раствор в -ном растворе едкого натра; е) анилинфталат: 1,66 г фталевой кислоты и 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 100 мл этилового спирта, насыщенного водой; ж) резорцин, -ный раствор в этиловом спирте. К 10 мл раствора резорцина добавляют 90 мл 2 н соляной кислоты.

Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 17 см, шириной с одного конца 1,8 см, а с другого — 1,3 см. На расстоянии 1,5-2 см от узкого конца полоски графитовым карандашом очерчивают круг диаметром 0,5 см. Широкий конец полоски прокалывают иглой, протягивают нитку, которую завязывают петлей. Смешивают по 1 мл стандартных растворов сахаров. Одновременно ставят 7—8 хроматограмм (каждую в отдельной пробирке или цилиндре): на две полоски с помощью микропипеток наносят по капле смеси растворов сахаров, на другие — по капле стандартного раствора одного из сахаров. Объем капли — Капли высушивают на воздухе.

В пробирки (или цилиндры) наливают растворитель (н-бутиловый спирт — пиридин — вода) в таком объеме,

чтобы толщина его слоя на дне сосуда составляла около 1,5-1,6 см. Наливая растворитель, надо следить за тем, чтобы не смочить им стенки пробирки. Полоски бумаги осторожно опускают в пробирки и погружают в жидкость на 2—3 мм, затем с помощью нитки и пробки закрепляют их в вертикальном положении (они не должны прикасаться к стенкам пробирки).

Хроматограммы выдерживают в сосудах 2-3 ч. Их вынимают, когда фронт растворителя приблизится к верхнему краю бумаги на 5—6 мм. Карандашом очерчивают уровень фронта растворителя и высушивают бумагу в течение 10 мин. при 100—105° С, после чего хроматограммы опрыскивают проявителями: одну из полосок, на которую была нанесена смесь сахаров, обрабатывают раствором бензидина или динитросалициловой кислоты, другую — раствором флороглюцина. Контрольные полоски, на которые был нанесен раствор только одного сахара, опрыскивают одним из проявителей, зная, что бензидин и динитросалициловая кислота реагируют только с восстанавливающими сахарами, а флороглюцин — с сахарозой и фруктозой. Полоски, обработанные проявителями, переносят в сушильный шкаф и прогревают 10 мин. при 100—105° С. Пятна пентоз окрашиваются в буровато-шоколадный цвет (окраска возникает быстро, ее можно заметить уже после 5-минутного нагрева), бурые пятна остальных восстанавливающих сахаров появляются через 8—10 мин. Пятна фруктозы и сахарозы окрашиваются флороглюцином в желто-оранжевый цвет.

Рассчитывают сахаров на опытных и контрольных хроматограммах.

Примечание. Вместо указанных проявителей можно пользоваться растворами анилинфталата и резорцина. Анилинфталат более чувствителен к альдозам, чем к кетозам, которые проявляются раствором резорцина. На хроматограммах, обработанных анилин-фталатом, желто-коричневые цвета глюкозы и галактозы проявляются при 100—105° С через 5 мин., пентозы окрашиваются в вишневый цвет. Мальтоза и лактоза проявляются после -минугного нагревания при 100—105° С. Полоски, увлажненные раствором резорцина, сушат 10 мин. при 85—90° С. Фруктоза дает пятна красного цвета, ксилоза и арабиноза — синего.

Если разделяют сахара на круговой хроматограмме, то смесь углеводов наносят на два сектора круга, а стандартные растворы — на остальные секторы.