ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (по Г. В. Колоболотскому)

Общие сведения

см. работу «Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии».

Разделение аминокислот в тонком слое силикагеля продолжается 1,5-2 ч, т. е. происходит в несколько раз быстрее, чем при хроматографии на бумаге. Чувствительность тонкослойной хроматографии в 5—10 раз выше бумажной.

Разделение аминокислот мышечной ткани проводят методом двухмерной восходящей хроматографии во взаимно перпендикулярных направлениях.

Реактивы и оборудование: а) хроматографические пластинки со слоем силикагеля «КСК» с добавлением 5—10% гипса. Подготовка силикагеля: силикагель «КСК» измельчают в течение 4-5 ч в шаровой мельнице, отбирают однородную фракцию с частицами 2,5-7,5 мкм и высушивают при 105° С до постоянного веса. Подготовка гипса: порошок гипса просеивают через капроновое сито № 64, после чего выдерживают 1 - 2 суток в сухожаровом шкафу при температуре 180° С; хранят в банке с притертой пробкой. Подготовка хроматографических пластин: в ступке тщательно растирают 0,3 г силикагеля, 0,03 г гипса с 3 мл дистиллированной воды; суспензию выливают на гладкую обезжиренную стеклянную пластинку длиной и шириной по 6 см, толщиной 2 мм. Пластинку кладут на строго горизонтальную поверхность и высушивают на воздухе в течение

12-14 ч, предохраняя от пыли; б) хроматографические сосуды. Берут батарейные стаканы высотой 13 см, диаметром 7 см и плоским дном внутри, с пришлифованной стеклянной крышкой (пластиной); внутреннюю поверхность стаканов на 75% по окружности покрывают фильтровальной бумагой; в) градуированные стеклянные капилляры на 0,001 мл; г) стеклянный горизонтальный столик для хроматографических сосудов; д) хлороформ, перегнанный при 61° С; е) метанол, перегнанный при 67° С; ж) аммиак, 25%-ный раствор; з) фенол, перегнанный при 182,7° С; и) нингидрин, 0,5%-ный ацетоновый раствор; к) система растворителей I: хлороформ — метанол — 25%.-ный водный аммиак, 5:3:1; л) система растворителей II: фенол — вода, 3:1.

Приготовление вытяжки из мышечной ткани.

1 г мяса тщательно растирают в ступке. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку. Ступку ополаскивают несколькими миллилитрами 90%-ного этанола и вливают в ту же пробирку, общий объем жидкости в которой доводят этанолом до 10 мл. Содержимое пробирки перемешивают, после чего ее ставят в штатив на 10—20 мин., затем центрифугируют в течение 15 мин. при 3000 об/мин. Центрифугат сливают в небольшую выпарительную чашку, к осадку в пробирке добавляют 10 мл 96%-ного этанола, снова центрифугируют 10—12 мин. и сливают в ту же чашку.

Объединенный центрифугат выпаривают досуха на водяной бане. К остатку добавляют 3 мл воды, переносят в пробирку и для освобождения от липидов взбалтывают 2—3 раза с диэтиловым эфиром. Эфирный слой осторожно отсасывают с помощью капилляра и водоструйного насоса. Водный слой выпаривают на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл воды.

Хроматография.

На пластинку со слоем адсорбента на расстоянии 1 см от края наносят с помощью капилляра каплю вытяжки.

Хроматографические сосуды ставят на горизонтальный стеклянный столик или другую строго горизонтальную поверхность и наливают систему растворителей I на высоту 0,5 см, потом вертикально устанавливают хроматографическую пластинку, чтобы часть ее ниже нанесенного пятна находилась в жидкости. Сосуд закрывают пришлифованной крышкой.

После того как растворитель поднимется по пластинке на 5 см, ее вынимают и переносят на 2—4 мин. в сушильный шкаф при температуре 105—110°. Высушенную пластинку снова ставят в тот же растворитель, затем высушивают. Описанную операцию повторяют три раза, после чего через слой адсорбента однократно пропускают систему II: пластинку переносят во второй сосуд и устанавливают в положение, перпендикулярное к тому, при котором производилось разделение аминокислот в системе растворителей I. Воздух в сосуде насыщают парами аммиака. Для этой цели на дно его ставят фарфоровый тигель или чашечку с 2%-ным раствором аммиака.

При разделении аминокислот во втором направлении хроматографию также ведут до тех пор, пока растворитель не поднимется по пластинке на 5 см, тогда ее вынимают, высушивают при 105° С до полного исчезновения запаха фенола (под тягой!). Высушенную пластинку опрыскивают раствором нингидрина и снова прогревают в течение нескольких минут в сушильном шкафу при 100—105° С. На пластинке появляются пятна аминокислот красновато-фиолетового или сине-фиолетового цвета.

Идентификация аминокислот.

Для идентификации сопоставляют расположение пятен аминокислот на хроматограмме испытуемого раствора с пятнами, которые получаются в результате нанесения на адсорбент растворов

Табл. 6. Количество аминокислот (мг), необходимое для приготовления 1 мл 0,01 М раствора

заведомо известных аминокислот («свидетелей» или «метчиков»). С этой целью готовят 0,01 М растворы аминокислот (раствор тирозина — 0,005 М). В табл. 6 указаны навески аминокислот (в миллиграммах на 1 мл воды), необходимые для приготовления растворов.

Рис. 10. Двухмерные хроматограммы аминокислот в тонком слое силикагеля (по Г. В. Колоболотскому): А - аминокислот-«свидетелей»; Б — вытяжки из свежего мяса: 1 — фенилаланин; 2 — лейцин; 3 — метионин; 4 — тирозин; 5 - валин; 6 — аланин; 7 - пролин; 8 — глицян; 9 — серин; 10 — гистиднн; И — глютаминовая кислота; 12 — аспарагиновая кислота; 13 — аргинин+лизин.

На пластинку наносят каплю раствора одной из аминокислот и хроматографируют так же, как и испытуемый раствор. После проявления хроматограммы находят аминокислоты. Так поступают и с растворами других аминокислот, получая 13—14 пластинок, на каждой из которых имеется пятно одной определенной аминокислоты.

На листе кальки вычерчивают квадрат со стороной 6 см. Квадрат накладывают на пластинки с пятнами аминокислот и на кальке отмечают расположение их пятен. Таким образом получают эталон, который накладывают на хроматограмму испытуемого раствора, определяя его аминокислотный состав.

Существует и другой вариант: на пластинку с силикагелем наносят смесь растворов перечисленных аминокислот. Расположение пятен аминокислот на хроматограмме переносят на кальку, которая служит эталоном для расшифровки хроматограммы вытяжки из мышечной ткани (рис. 10).