ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ

Общие сведения.

Дезаминирование — один из путей дальнейшего превращения аминокислот в организме. В результате этого процесса аминокислоты отщепляют аммиак и превращаются в безазотистые соединения. Возможны несколько типов дезаминирования:

а) окислительное

б) восстановительное

в) гидролитическое

Окислительное дезаминирование превалирует у животных, растений и многих видов микроорганизмов, другие типы дезаминирования встречаются главным образом у некоторых анаэробных микробов. Окислительное дезаминирование протекает в два этапа.

Первый этап

Промежуточными акцепторами водорода являются НАД или ФМН, которые восстанавливаются до НАД или ФМН . В дальнейшем водород восстановленных форм коферментов переносится на кислород с образованием воды.

Второй этап. Иминокислота присоединяет воду и распадается на кетокислоту и аммиак:

Второй этап проходит спонтанно, без участия ферментов.

Окислительное дезаминирование D-, L-аланина.

D-, L-аланин под действием фермента оксидазы-Д-аминокислот окисляется в пировиноградную кислоту. При этом отщепляется аммиак, который можно определить с помощью реактива Несслера.

Реактивы: а) ферментный препарат оксидазы-Д-аминокислот. Освобожденные от капсулы почки крысы на холоду тщательно разрезают ножницами на мелкие кусочки, которые затем растирают в ступке в кашицу. Кашицу дважды экстрагируют 10-кратным объемом охлажденного ацетона. Ацетон отсасывают на воронке Бюхнера, а осадок два раза промывают диэтиловым эфиром.

Эфир испаряют на воздухе (в вытяжном шкафу), выключив в лаборатории нагревательные приборы. Порошок ферментного препарата хранят в холодильнике. Он сохраняет свою активность в течение 5—7 дней. Перед употреблением порошок экстрагируют 20 мин. фосфатной буферной смесью (pH 7,6) в отношении 1 : 20, после чего центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин.; б) D-, L-аланин, 2,5%-ный раствор на фосфатной буферной смеси (pH 7,6); в) фосфатная буферная смесь pH 7,6 (приготовление см. прил. 12); г) серная кислота, 10%-ный раствор; д) реактив Несслера (см. работу «Колориметрическое определение общего количества азота»).

Опыт проводят в трех пробирках. В первую вносят 1 мл ферментного препарата (центрифугата) и 1 мл фосфатного буфера, во вторую — 1 мл раствора аланина и 1 мл буферной смеси, в третью — 1 мл ферментного препарата и 1 мл раствора аланина. Все пробы тщательно перемешивают, плотно закрывают заранее подобранными пробками и помещают в водяную баню 37—38° С на 1 ч (лучше пользоваться ультратермостатом). Во время инкубации тщательно следят за температурой воды в бане, не допуская ее повышения. По истечении указанного срока во все пробирки приливают по 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты и 3-4 мл реактива Несслера и наблюдают за окраской жидкости. В опытной пробе (третья пробирка) появляется интенсивное желто-оранжевое окрашивание (до желто-бурого), вызванное продуктом взаимодействия аммиака с реактивом Несслера (иодидом меркураммония). Жидкость в первой и второй пробирках, которые служили контролем, примет бледно-желтую окраску.