Исследование физико-химических свойств белковых веществ

Диализ. С помощью диализа очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.).

Реактивы: а) раствор яичного белка с хлористым натрием (приготовление — см. с. 6); б) азотнокислое серебро, 0,5%-ный раствор (в склянке темного стекла); в) азотная кислота, 10%-ный раствор; г) едкий натр, 10%-ный раствор-, д) сернокислая медь, 1%-ный раствор.

В мешочек из целлофана или коллодия (или в высушенный пузырь теленка, поросенка) наливают до половины раствор яичного белка (с хлористым натрием). Мешочек подвешивают на стеклянной палочке и погружают в стакан с дистиллированной водой (рис. 1). Диализ проводят при комнатной температуре. Через 40—60 мин. из стакана берут в две пробирки по 2 мл воды. В одной пробирке проводят реакцию на ионы хлора, для чего воду подкисляют несколькими каплями 10%-ного раствора азотной кислоты и добавляют 2—3 капли раствора азотнокислого серебра, выпадает белый осадок хлористого серебра. С пробой во второй пробирке производят биуретовую реакцию.

Рис. 1. Простейший диализатор.

Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.

Диализ можно ускорить, периодически меняя воду в стакане (через каждые 15—20 мин.) или же используя проточный диализатор.

Диализ проводят до получения отрицательной реакции на ионы хлора.

Примечания: 1. Для приготовления мешочков рекомендуется разрезать целлофан на куски размером 12,5 х 12,5 см.

2. Для приготовления мембраны из коллодия в чисто вымытую и высушенную круглодонную колбу емкостью 50 мл или большую пробирку наливают коллодий -ный раствор нитроклетчатки в смеси эфира со спиртом) и почти сразу же выливают обратно в склянку.

Медленно вращая колбу или пробирку, равномерно распределяют остатки коллодия по ее стенкам. Сосуд оставляют на несколько минут до исчезновения запаха эфира, после чего 2—3 раза ополаскивают небольшими порциями дистиллированной воды (по ) для удаления следов спирта.

Во время ополаскивания пленка начинает отслаиваться от стенок сосуда, тогда ее осторожно отделяют пинцетом. Чтобы ускорить отделение, осторожно наливают воду между отслоившейся пленкой и стенкой сосуда.

Определение изоэлектрической точки белка.

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение

pH, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Например, для казеина pH равно 4,7, для яичного альбумина — 4,8, желатина — 4,9, зеина (кукурузного белка) — 6,2; у прота-минов и гистонов изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной среде.

Выпадение белка в осадок в изоэлектрической точке можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ (спирта, ацетона, эфира) или танина. Одни из них (органические растворители) уменьшают степень гидратации белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, другие, как, например, танин, образуют нерастворимые в воде соединения с азотистыми гетероциклическими группировками.

Реактивы: а) желатин, -ный раствор; б) уксусная кислота, 0,1 н раствор; в) уксуснокислый натрий, 0,1 н раствор; г) этиловый спирт, 96%-ный; д) танин, 0,1%-ный раствор.

В пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в табл. 1, после чего в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта (или по 1 мл раствора танина) и снова перемешивают. Через 5—10 мин. просматривают все пробирки и оценивают степень мутности смеси в каждой из них. pH наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу, которую составляют по образцу табл. 1.

Табл. 1. Определение изоэлектрической точки белка

Реакции осаждения белков.

Многие факторы влияют на физико-химические свойства белковых веществ, вызывают изменения структуры макромолекул. Данный процесс известен как денатурация. При денатурации нарушается активная конформация белковой макромолекулы. Эти изменения касаются в первую очередь вторичной и третичной структуры без нарушения при этом ковалентных (пептидных) связей.

Факторы, вызывающие денатурацию, можно разделить на две группы: физические и химические. К физическим относятся высокая температура, механические воздействия, обработка ультразвуком, действие ионизирующих излучений; к химическим — осаждение ионами тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, нейтральными солями аммония, щелочных и щелочноземельных металлов; органическими растворителями, алкалоидными реактивами. Аналогичное по результатам действие оказывают детергенты, мочевина, некоторые красители.

Механизм действия некоторых физических факторов следует рассматривать как комбинированный, например, воздействие ультразвуковых волн и ионизирующих излучений приводит также к химическим изменениям белковых макромолекул.

Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.

При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе (например, воде). Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, он теряет свойства гидрофильности и становится гидрофобным. Денатурированный белок неспособен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реактивов, детергентов, красителей.

Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание). Соли нейтральные аммония, щелочных и щелочноземельных металлов и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Этот способ осаждения белков называют высаливанием. Высаливание — обратимый процесс. Осадки можно снова растворить в воде, при этом наблюдается значительная степень восстановления свойств белков (например, ферментативной активности, антигенных свойств и т. д.). Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

Реактивы: а) раствор яичного белка с хлористым натрием (приготовление — см. с. 6); б) хлористый натрий, кристаллический, тонко растертый порошок (в виде пудры); в) сернокислый аммоний, кристаллический, тонко растертый порошок; г) сернокислый аммоний, насыщенный раствор; д) сернокислый магний, кристаллический, тонко растертый порошок; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор: ж) едкий натр, -ный раствор; з) сернокислая медь, 1%-ный раствор.

Осаждение сернокислым аммонием. В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в "растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция соли уже не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Если произошло полное осаждение белков, она должна быть отрицательной.

Осаждение сернокислым магнием или хлористым натрием. В 2 пробирки наливают по 2-3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую — сернокислого магния. Через 5—6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков

(глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах — альбумины. Фильтраты подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты — появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка. Осаждение белков путем высаливания применяется в промышленности.

Осаждение белков органическими растворителями. Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) вызывают дегидратацию белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки (гидросферы), что понижает устойчивость белков в растворе и ведет к выпадению в осадок. Лучше всего происходит осаждение белков из нейтрального или слабокислого раствора, в щелочных растворах осаждение органическими растворителями затормаживается. Способствует осаждению также присутствие электролитов (например, хлористого натрия) в растворе.

Осаждение белков спиртом обратимо при условии, если процесс проводили без нагревания и воздействие реагента было кратковременным. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) этиловый спирт (или ацетон); в) хлористый натрий, кристаллический.

В пробирку наливают 1-2 мл раствора яичного белка, добавляют немного порошка хлористого натрия (на кончике шпателя) и взбалтывают до растворения. По каплям приливают 4-6 мл этилового спирта, сильно взбалтывают. Через 5—8 мин. выпадает осадок белка.

Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки (с осадком) в другую, добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды. Концентрация спирта падает, а белок снова переходит в раствор.

Тепловая денатурация белков. Свертывание большинства белков начинается уже при температуре 50—55°. Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят

исходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул. Нагревание вызывает разрыв дисульфидных связей между полипептидными цепями, что приводит к их раскручиванию и изменению конформации макромолекул. При кратковременном нагревании (при относительно невысоких температурах) денатурация может и не произойти или проявиться в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры (а особенно при кипячении) ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние pH раствора и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. Сдвиги pH в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды.

Прибавление электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс коагуляции даже в кислой среде.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) раствор растительных белков; в) уксусная кислота, 1%-ный раствор; г) уксусная кислота, 10%-ный раствор; д) едкий натр, 10%-ный раствор; е) хлористый натрий, насыщенный раствор.

В пять пробирок наливают по 1-2 мл раствора яичного или растительного белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения: раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг белковых частиц), но осадок не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные заряды, что препятствует их коагуляции.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают: осадок белка выпадает быстро, поскольку заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5— 8 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения: осадок не образуется, так как мицеллы

белка приобрели положительные заряды, что является стабилизирующим фактором и препятствует коагуляции.

В четвертую пробирку добавляют 5—8 капель 10%-ного раствора едкого натра и нагревают до кипения: осадок не выпадает, поскольку мицеллы заряжены отрицательно.

В пятую пробирку прибавляют 4—5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 5—6 капель насыщенного раствора хлористого натрия, нагревают до кипения — белок выпадает в осадок.

Осаждение белков минеральными кислотами. Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию Их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. Все это ведет к необратимой денатурации белка. Ортофосфорная кислота не образует осадков с белками.

Осадки, вызванные действием минеральных кислот, растворяются в избытке серной и соляной кислот, но не растворяются в азотной.

Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) серная кислота, концентрированная; г) азотная кислота, концентрированная; д) соляная кислота, концентрированная.

В три пробирки наливают по 1 мл кислот: в первую — серной, во вторую — азотной, в третью — соляной. Пробирки наклоняют под углом 45° и осторожно (из пипетки) наслаивают по стенке раствор белка ( пробирку держат отверстием от себя). На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.

Пробирки осторожно встряхивают и добавляют в первую — избыток серной, во вторую — азотной, в третью — соляной кислоты. Осадки белка растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной.

Реакция находит применение для быстрого ориентировочного определения белка в биологических жидкостях (например, в моче).

Осаждение белков органическими кислотами. Органические кислоты необратимо осаждают белок из растворов. Различные кислоты отличаются по силе действия.

Наиболее эффективно и специфично действие сульфо-салициловой и трихлоруксусной кислот.

Под действием трихлоруксусной кислоты осаждаются только белки, сульфосалициловая же кислота, кроме белков, осаждает также высокомолекулярные продукты их распада — пептоны и полипептиды.

Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) сульфосалициловая кислота, -ный раствор, г) трихлоруксусная кислота, -ный раствор.

В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую 5—8 капель раствора сульфосалициловой, а во вторую — столько же раствора трихлоруксусной кислоты. В обеих пробирках белок выпадает в осадок.

Осаждение белков солями тяжелых металлов. Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов.

Характер взаимодействия белков с ионами тяжелых металлов сложен и многогранен. Это прежде всего образование комплексных соединений, нерастворимых в воде, но растворяющихся в избытке соли (кроме ); соли тяжелых металлов, адсорбируясь на белковых мицеллах, изменяют их электрический заряд (вплоть до полной нейтрализации). Денатурация белков солями тяжелых металлов вызывается глубокими нарушениями вторичной и третичной структур макромолекул белка, изменением положения пептидных цепей, которое обусловливается в основном разрывом связей между ними (главным образом дисульфидных). Дисульфидным связям принадлежит видная роль в поддержании вторичной и третичной структур белка. Разрыв их влечет за собой

изменение структур — необратимую денатурацию белка.

Растворение осадка белков в избытке соли объясняется явлением адсорбционной пептизации. Ионы металла, адсорбируясь на поверхности белковых мицелл, придают им положительные заряды. Одноименно заряженные мицеллы отталкиваются, что способствует их переходу из осадка в раствор.

Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) уксуснокислый свинец, 5%-ный раствор; г) азотнокислое серебро, 2,5%-ный раствор; д) хлорное железо, 5%-ный раствор, е) сернокислая медь, 5%-ный раствор.

В четыре пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую — уксуснокислого свинца, во вторую — сернокислой меди, в третью — хлорного железа, в четвертую — азотнокислого серебра (до выпадения осадков). Затем прибавляют избыток указанных реактивов и наблюдают растворение осадков в первых трех пробирках. Осадок, вызванный прибавлением азотнокислого серебра, не растворяется в избытке соли.

Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути и др.

Осаждение белков реактивами на алкалоиды. Алкалоиды — азотсодержащие вещества основного характера, обладающие сильным физиологическим действием. В большинстве своем являются гетероциклическими соединениями, производными пиридина, пиррола, пирролидина, хинолина, индола, пурина и др. К алкалоидам относятся, например, морфин, папаверин, атропин, кофеин, эфедрин и ряд других соединений, которые находят широкое применение в лечебной практике.

Многие так называемые общие реактивы на алкалоиды вызывают также осаждение белковых веществ. К ним относятся: танин, раствор иода в иодистом калии (реактив Бушарда), раствор йодистого висмута в иодистом калии (реактив Драгендорфа), пикриновая кислота и др.

Осаждение белковых веществ общими реактивами на алкалоиды обусловлено тем, что в состав аминокислот

и алкалоидов входят сходные гетероциклические группировки (индольные, имидазольные, пирролидиновые и др.).

Алкалоидные реактивы образуют нерастворимые соединения с белками. Слабое подкисление органической кислотой (например, уксусной) благоприятствует реакции и, наоборот, добавление сильных минеральных кислот затормаживает этот процесс. Осадки растворяются в щелочной среде.

Реактивы: а) раствор яичного (или растительного белка; б) пикриновая кислота, 1%-ный раствор; в) танин, свежеприготовленный 10%-ный раствор; г) реактив Бушарда: 1 г иода, 2 г йодистого калия, 50 мл воды. Йодистый калий (иодид калия) растворяют в нескольких миллилитрах воды. В концентрированном растворе соли растворяют иод и затем доливают остальное количество воды; д) реактив Драгендорфа (раствор йодистого висмута в иодистом калии). 13,5 г йодистого калия (нодида калия) растворяют в 20 мл воды. Отдельно готовят раствор 2,5 г основного азотнокислого висмута в 10 мл азотной кислоты Смешивают оба раствора и оставляют (в склянке темного стекла) на 2—3 дня. На дно сосуда выпадают кристаллы азотнокислого калия. Прозрачный раствор осторожно сливают с осадка и доводят его объем водой до 50 мл. Хранят в склянке темного стекла; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор.

В четыре пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 1%-ного раствора уксусной кислоты, после чего в первую пробирку приливают 4—5 капель раствора пикриновой кислоты, во вторую — 2—3 капли раствора танина, в третью — 2—3 капли реактива Бушарда, в четвертую — столько же реактива Драгендорфа.

Наблюдают выпадение осадков.

Образование хелатов.

Ионы тяжелых металлов образуют с аминокислотами внутрикомилексные соединения, так называемые хелаты.

При образовании хелатов ионы металла вступают в связи с молекулой аминокислоты, в состав которой входят две группы, способные соединяться с металлами (карбоксильная и аминогруппа). Эти связи являются частично ионными и частично ковалентными, так как одна из реакционноспособных групп аминокислоты образует с металлом ионную связь, а другая вступает в комплексную

ковалентную связь, при которой свободная пара электронов дополняет незавершенную структуру внешней электронной оболочки металла. В растворах хелатов металлы не образуют положительно заряженных ионов. Строение внутрикомплексного соединения аминокислоты глицина (гликоколла) с ионами меди может быть представлено следующей формулой:

Реактивы: а) глицин (гликоколл), 2%-ный раствор; б) углекислая основная медь , в порошке.

К 2-3 мл раствора глицина добавляют (на кончике шпателя) немного основной углекислой меди, нагревают до кипения и кипятят 1 мин. Горячий ярко-синий раствор фильтруют. В фильтрате через некоторое время заметны тонкие игольчатые кристаллы глицин-медного внутрикомплексного (хелатного) соединения.