ГИДРОЛИТИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ БЕЛКА ФЕРМЕНТАМИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Пептоны, образовавшиеся при переваривании белков в желудке, а также белки, поступившие в двенадцатиперстную кишку в непереваренном виде, подвергаются воздействию протеолитических ферментов, выделяющихся главным образом поджелудочной железой и частично клетками слизистой оболочки тонкого кишечника.

В соке поджелудочной железы содержатся трипсин, химотрипсин и карбоксипептидаза.

Трипсин — один из важнейших протеолитических ферментов. Он выделяется в виде неактивного профермента трипсиногена. Под влиянием фермента энтерокиназы, содержащегося в кишечном соке, трипсиноген превращается в активную форму — трипсин. Трипсин катализирует гидролитическое расщепление не только полипептидов, образовавшихся при распаде белков в желудке, но и тех белков, которые поступили в кишечник в непереваренном виде. Оптимум действия трипсина лежит при pH 7,8. Под влиянием трипсина происходит гидролитический распад пептидных связей с образованием низкомолекулярных полипептидов со значительно меньшей величиной молекулы, чем у исходных веществ, а также небольшого количества свободных аминокислот.

Химотрипсиноген тоже выделяется в неактивном виде и активируется трипсином. Химотрипсин, как и трипсин, катализирует процесс гидролиза пептидных связей полипептидов и белков. Трипсин с наибольшей скоростью расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильными группами лизина и аргинина, тогда как химотрипсин действует главным образом на пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана.

Дальнейшее расщепление полипептидов происходит под действием пептидаз — карбоксипептидазы, амино-пептидазы и дипептидаз. Карбоксипептидаза катализирует процесс гидролиза полипептида со стороны свободной карбоксильной группы. Аминопептидаза и дипептидазы содержатся в соке тонких кишок. Аминопептидаза катализирует гидролитическое расщепление полипептида со стороны свободной аминогруппы. Дипептиды, образовавшиеся в результате действия перечисленных ферментов, расщепляются (при участии дипептидаз) на свободные аминокислоты. Таким образом, конечными продуктами гидролитического расщепления белков в желудочно-кишечном тракте являются аминокислоты, которые и усваиваются организмом.

Определив содержание азота а-аминокислот в белке до его контакта с ферментом и затем через некоторое время, в процессе расщепления, можно установить интенсивность процесса гидролиза.

Содержание азота аминокислот (аминного азота) определяют с помощью метода, основанного на том, что а-аминокислоты и пептиды образуют внутрикомплексные соединения с ионами двухвалентной меди. Указанные соединения реагируют с иодистым калием в кислой среде, при этом выделяется иод, который оттитровывают серноватистокислым натрием (гипосульфитом, тиосульфатом).

Реакции протекают по следующим уравнениям:

1 мл 0,01 н раствора гипосульфита соответствует 0,28 мг азота аминокислот.

Реактивы: а) желатин, 1%-ный раствор; б) панкреатин (препарат поджелудочной железы): 2 г препарата растворяют в 20 мл 1%-ного раствора двууглекислого натрия (гидрокарбоната натрия). Раствор фильтруют; в) хлорная медь: 27,3 г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят водой до метки; г) натрий фосфорнокислый трехзамещенный г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят водой до метки. Раствор ожно готовить также из двухзаме-щенного фосфорнокислого натрия. В этом случае 64,5 г растворяют в 500 мл дистиллированной воды (предварительно прокипяченной для освобождения от и остуженной), раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 7,2 г едкого натра, после растворения которого раствор доводят водой до метки; д) боратный буфер (pH 8,8): 28,6 г буры (тетра-борнокислого натрия) растворяют в 750 мл воды (в мерной колбе на 1 л), прибавляют 50 мл нормального раствора соляной кислоты и доводят водой до метки; е) суспензия фосфорнокислой меди в боратном буфере: 100 мл раствора хлорной меди смешивают с 200 мл раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и добавляют 200 мл боратного буферного раствора. Суспензию готовят не более чем на один день, лучше

всего перед употреблением; ж) тимолфталеин.: 0,25 г индикатора растворяют в этилового спирта; з) тиосульфат натрия, гипосульфит н раствор. Перед употреблением из него готовят 0,01 н раствор; и) крахмал, 0,5%-ный раствор; к) иодистый калий (KJ), 10%-ный раствор. Готовят перед употреблением; уксусная кислота, концентрированная; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; н) едкий натр, 1 н раствор.

Нумеруют четыре конические колбы емкостью по 50 мл. Во все колбы вносят по 2 мл раствора панкреатина. В колбах 3 и 4 нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин. разрушают ферменты, в колбах 1 и 2 остаются активные ферменты.

В колбы 1 и 3 пипеткой вносят по 20 мл раствора желатина, в колбы 2 и 4 — по 20 мл дистиллированной воды. Растворы во всех колбах перемешивают и немедленно отбирают из каждой колбы по 2-5 мл смеси в мерные колбы на 25 мл для определения азота аминокислот.

В каждую мерную колбу еще до внесения смеси наливают по 2 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивирования ферментов. В первую очередь добавляют трихлоруксусную кислоту в колбу 1.

В растворах, внесенных в мерные колбы, определяют содержание азота аминокислот.

Все исходные смеси (в конических колбах) ставят на 1 ч в термостат при температуре 38° С.

Для определения азота аминокислот в каждую мерную колбу прибавляют 2 капли раствора тимолфталеина и по каплям 1 н раствор едкого натра до светло-голубого окрашивания (pH 10,2). К нейтрализованным растворам доливают по 10 мл суспензии фосфорнокислой меди и тщательно перемешивают. Если весь объем суспензии прореагировал, добавляют еще 5 мл.

Колбы доводят водой до метки, хорошо перемешивают и смесь фильтруют (через фильтр из плотной бумаги) или центрифугируют. Фильтрат (или центрифугат) должен быть совершенно прозрачным.

Примечание. В случае необходимости фильтрат (цеитри-фугат) можно оставить на следующий день (в темном и холодном месте).

В две конические колбы пипеткой вносят по 10 мл фильтрата, прибавляют по 0,5 мл уксусной кислоты и

5 мл раствора иодистого калия (или 0,5 г порошка KJ), выделившийся иод тотчас же оттитровывают 0,01 н раствором тиосульфата натрия (гипосульфита). Раствор тиосульфата добавляют до тех пор, пока окраска жидкости в колбе не станет светло-желтой, после чего приливают 5—6 капель раствора крахмала и дотитровывают тиосульфатом до обеспечивания синей окраски.

На основании результатов титрований вычисляют содержание азота аминокислот во всем объеме каждого из исходных растворов (в конических колбах). Данные, характеризующие содержание аминного азота в колбах 2 или 4, будут указывать на количество свободного азота аминокислот в 2 мл ферментного препарата (раствора панкреатина). Разность в содержании азота аминокислот в колбах 3 и 4 указывает на количество азота свободных аминогрупп в 20 мл раствора желатина. Разность в содержании аминного азота в колбах 1 и 2 (1—2) должна быть практически такой же, как и в колбах 3 и 4 (3-4).

После часа инкубации колбы вынимают из термостата и повторяют определения аминного азота. Данные анализа пересчитывают на исходный объем смеси — 2 мл (2 мл раствора панкреатина + 20 мл раствора желатина или воды).

Разность между содержанием аминного азота в колбах 3 и 4 должна быть такой же, как и до инкубации, разность же между колбами 1 и 2 должна возрасти после инкубации по сравнению с той же величиной в начале опыта.

Иногда наблюдаются случаи, когда содержание азота аминокислот в колбе 2 после инкубации оказывается более высоким, чем в колбе 4. Это свидетельствует о самопереваривании (автолизе) ферментного препарата.

Рассмотрим следующий пример расчета.

В коническую колбу внесли 2 мл раствора панкреатина и 20 мл раствора желатина; оттуда в мерную колбу для определения аминного азота отобрали 2 мл смеси. После фильтрования были отобраны две пробы по 10 мл прозрачного фильтрата, на титрование которых израсходовали соответственно 1,92 и 1,96 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия (среднее-1,94 мл).

1 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия (гипосульфита) соответствует 0,28 мг азота аминокислот.

Количество азота аминокислот в объеме мерной колбы (25 мл)

Содержание азота аминокислот в исходном растворе (22 мл)