ИССЛЕДОВАНИЕ АНАЭРОБНОГО РАСПАДА ГЛИКОГЕНА ИЛИ КРАХМАЛА

Анаэробный распад гликогена (гликогенолиз) или глюкозы (гликолиз) начинается с этапа образования глюкозофосфорных эфиров. При гликогенолизе вначале образуется глюкозо-1-фосфат, который затем под влиянием фермента фосфоглюкомутазы превращается в глюкозо-6-фосфат. При фосфорилировании глюкозы процесс начинается с образования глюкозо-6-фосфата.

Наряду с фосфорилитическим распадом гликогена в мышцах имеет место (правда, в значительно меньшей степени) и гидролитическое расщепление его под влиянием амилазы и мальтазы.

Схематически процесс анаэробного расщепления углеводов в мышцах можно представить следующим образом.

Таким образом, если к кашице мышечной ткани добавить раствор гликогена или крахмала и эту смесь поместить в анаэробные условия при температуре 36,5- 37° С, то через 1-2 ч можно наблюдать образование молочной кислоты, которую открывают реакцией с серной кислотой и гваяколом или с серной кислотой и спиртовым раствором тиофена в присутствии сернокислой меди.

Реактивы и материалы: а) кашица мышечной ткани. Мышцы только что убитого кролика, крысы или лягушки нарезают ножницами на маленькие кусочки (на холоду). Кашицу готовят непосредственно перед употреблением, растирая нарезанные мышцы с небольшим количеством дистиллированной воды; б) фосфатный буфер Готовят два раствора: М раствор ( г соли в 1 л); М раствор г соли в . Для получения буферной системы смешивают 95 мл первого раствора с 5 мл второго; в) метафосфорная кислота, -ный раствор; г) гликоген или крахмал, -ный раствор; д) вазелиновое масло; е) гидрат окиси кальция в порошке; ж) сернокислая медь, -ный раствор; з) серная кислота, концентрированная; и) гваякол (монометиловый эфир пирокатехина), -ный спиртовой раствор; к) тиофен, 10—20 капель препарата растворяют в 100 мл этилового спирта.

В две пробирки вносят по 0,5 г свежеприготовленной мышечной кашицы и 3 мл фосфатного буфера (pH 8,04). Первая пробирка служит контрольной, вторая — опытной. В контрольную пробирку для инактивации ферментов добавляют раствора метафосфорной кислоты и 1 мл дистиллированной воды. Во вторую пробирку вливают раствора крахмала или гликогена, затем в обе пробирки добавляют по 1 мл вазелинового масла (для защиты реагирующих веществ от кислорода воздуха) и ставят на 1 ч в термостат при температуре . После часа инкубации пробирки вынимают из термостата и во второй инактивируют ферменты добавлением раствора метафосфорной кислоты. Контрольную и опытную пробы фильтруют через бумагу в сухие пронумерованные пробирки. Для осаждения углеводов к фильтратам прибавляют по 0,5 г гидрата окиси кальция и раствора сернокислой меди, потом пробирки ставят на 10—15 мин., время от времени взбалтывая, после чего снова фильтруют.

С фильтратами проделывают реакции на молочную кислоту. Для этого в четыре пробирки наливают: в первые две — по 10 капель фильтрата контрольной пробы, в третью и четвертую — по 10 капель опытной. Пробирки ставят в сосуд со снегом и осторожно (по стенке) добавляют в каждую из них по 30—40 капель концентрированной серной кислоты, во вторую и четвертую приливают также по 1 капле раствора сернокислой меди. После этого все пробирки нагревают на кипящей водяной бане 2—3 мин. и быстро охлаждают. В первую и третью пробирки наливают по 3—4 капли 0,2%-ного спиртового раствора гваякола, во вторую и четвертую — столько же спиртового раствора тиофена. Через несколько минут в третьей пробирке появляется красное окрашивание, в четвертой — вишнево-красное, которое усиливается при нагревании на водяной бане. В первой и второй пробирках может появиться розоватая окраска, обусловленная наличием следов молочной кислоты в мышечной кашице.

Примечание. Опыт проводят в пробирках из термоустойчивого стекла, соблюдая все меры предосторожности, принятые при работе с концентрированной серной кислотой.