ОЧИСТКА И РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (по Шмидту и Таннгаузеру, в прописи Г. П. Георгиева)

Реактивы и материалы: а) селезенка, печень, почки; б) трихлоруксусная кислота, 5-10-50%-ные растворы, в) кали едкое (КОН), 0,5 н раствор; г) этиловый спирт, 95%-ный; д) диэтиловый эфир-, е) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (3:1); ж) смесь этилового спирта с хлороформом (3:1); з) хлорная кислота раствор. Раствор готовить осторожно, так как хлорная кислота нестойка и может взорваться при хранении (особенно при повышенной температуре), а также при соприкосновении с органическими веществами.

Процесс выделения, очистки и разделения нуклеиновых кислот состоит из ряда последовательных этапов.

1. 1 г ткани (сырой вес) измельчают в стеклянном гомогенизаторе с 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты на холоду до получения однородной тонкой кашицы

(гомогенизатор охлаждают льдом), которую, количественно смывая со стенок гомогенизатора 5 мл 10%-ного холодного раствора уксусной кислоты, переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 7 мин. (3000—4000 об/мин) в центрифуге с охлаждением или низкотемпературной комнате. Жидкость над осадком сливают, к осадку вновь приливают 5-10 мл 10%-ного холодного раствора трихлоруксусной кислоты и снова центрифугируют. Операцию повторяют в третий раз. Промывные воды соединяют.

В осадке остаются нуклеиновые кислоты, белки и липиды, в промывные воды переходят низкомолекулярные производные азотистых оснований (в том числе нуклеотиды) и неорганические фосфорные соединения.

Примечание. Все операции необходимо проводить при низкой температуре во избежание отщепления пуринов (апуринизации) и последующего разрыва цепей ДНК при щелочном гидролизе.

2. Осадок освобождают от липидов путем экстракции органическими растворителями, для чего его растирают стеклянной палочкой и последовательно центрифугируют с этиловым спиртом, два раза со смесью спирта с хлороформом (3: 1), затем со смесью спирта с эфиром (3:1) и наконец с эфиром. Каждый раз берут по 10 мл растворителя. Промытый осадок высушивают на воздухе; для ускорения сушки его растирают стеклянной палочкой.

В осадке остаются нуклеиновые кислоты и белки.

3. Производят разделение РНК и ДНК

При мягком щелочном гидролизе РНК расщепляется до нуклеотидов, тогда как ДНК остается полимерной и выпадает в осадок при добавлении кислоты (хлорной или трихлоруксусной).

К высушенному на воздухе и растертому в порошок осадку добавляют 5—10 мл 0,5 н раствора КОН и ставят на 15-18 ч в термостат при 37° С, после чего охлаждают до и добавляют холодный 5 н раствор хлорной кислоты () из расчета 0,2 мл раствора на каждый миллилитр гидролизата.

Примечание. Вместо взрывоопасной концентрированной хлорной кислоты лучше использовать 50%-ный раствор трихлоруксусной, который добавляют к гидролизату с таким расчетом, чтобы довести концентрацию кислоты в нем (после нейтрализации КОН) до 5%.

После добавления кислоты гидролизат в течение 5 мин. выдерживают в холодильнике при 0° С и затем центрифугируют.

В надосадочной жидкости содержатся нуклеотиды, которые освободились при гидролитическом расщеплении РНК. Надосадочную жидкость сливают, соединяют ее с промывными водами, полученными в первом этапе. В жидкой фракции определяют содержание РНК.

В осадке остаются ДНК и белки.

4. Осадок растворяют в 0,5 н растворе КОН при 37° С, затем охлаждают до 0° С. Раствор сливают и в нем определяют содержание ДНК. Осадок нерастворимых веществ выбрасывают.