ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА АМИНОКИСЛОТ

Основные понятия.

При количественном определении азота аминокислот применяют различные методы (газометрические, например по Ван-Слайку или Д. А. Цуверкалову,

титриметрические, колориметрические, фотометрические). Благодаря своей простоте и вполне удовлетворительной точности наибольшее распространение получили метод формольного титрования и различные варианты медного способа — по Попе и Стивенсу, Войвуду и др.

Определение азота аминокислот методом формольного титрования.

Аминные группы аминокислот вступают в реакцию с формальдегидом с образованием метиленовых соединений (метиленаминокислот)

Метиленаминокислоты обладают более сильными кислотными свойствами, чем аминокислоты, и легко оттитровываются щелочью

По количеству раствора щелочи израсходованному на титрование, можно рассчитать содержание азота аминогрупп. При этом принимают, что количество карбоксильных групп, оттитрованных щелочью, эквивалентно количеству аминогрупп, прореагировавших с формальдегидом. Это справедливо лишь для моноамино-монокарбоновых аминокислот. Диаминомонокарбоновая кислота аргинин не реагирует с формальдегидом, поэтому не участвует в реакции. При титровании тирозина взаимодействуют со щелочью не только карбоксильная, но и фенольная группа.

Достоинствами метода формольного титрования являются быстрота и удобство определения. Это — основная причина его широкого распространения в практике, несмотря на относительно невысокую точность.

Реактивы: а) глицин, 0,02 М раствор; б) формалин, 40%-ный; в) этиловый спирт, 95-96%-ный; г) тимолфталеин: 0,05 г индикатора растворяют в 100 мл

96%-ного этилового спирта; д) метиловый красный: 0,2 г индикатора растворяют в 100 мл 60%-ного этилового спирта; е) фенолфталеин: 0,5 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 90%-ного этилового спирта; ж) едкий натр, растворы 0,2 н и 0,05 н концентрации.

В стаканчик или коническую колбу наливают 20 мл раствора глицина. В другой такой же сосуд вливают 20 мл воды, заранее прокипяченной (для освобождения от ) и охлажденной, которая служит контролем.

В оба сосуда добавляют по 3 капли индикатора метилового красного и титруют 0,05 н раствором едкого натра до появления отчетливого желтого окрашивания. После этого в сосуды доливают по 10 мл формольной смеси.

Для приготовления формольной смеси к 50 мл 40%-ного формалина добавляют 2 мл 0,5 %-ного раствора фенолфталеина и оттитровывают 0,2 н раствором едкого натра до слаборозового окрашивания (обычно расходуют не больше 5 капель раствора щелочи).

После добавления формольной смеси опытную и контрольную пробы титруют 0,2 н раствором едкого натра до появления интенсивной красной окраски (pH 9,1). Сначала титруют одну из проб, затем вторую дотитровывают до той же окраски.

При расчетах содержания аминного азота испытуемого раствора принимают во внимание, что н раствора соответствует 2,8 мг азота:

где А — количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное на титрование опытного образца, В — количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное на титрование контрольного образца, — поправочный коэффициент 0,2 н раствора едкого натра.

Полученный результат пересчитывают затем на 100 г исследуемого вещества.

При формольном титровании вместо индикатора фенолфталеина часто рекомендуют пользоваться раствором тимолфталеина, у которого синее окрашивание проявляется, если pH равно 9,5-9,7. Доказано, что при применении фенолфталеина титрование идет не совсем до конца, при добавлении же тимолфталеина карбоксильные группы аминокислот оттитровываются более полно.

С тимолфталеином анализ проводят так же, как и при добавлении фенолфталеина, но формольную смесь готовят несколько иначе: к 50 мл 40%-ного формалина приливают 25 мл 95-96%-ного этилового спирта, 5 мл раствора тимолфталеина и добавляют (по каплям) 0,2 н раствор едкого натра до появления зеленоватого или зеленовато-голубого окрашивания. Опытный и контрольный образцы оттитровывают 0,2 н раствором едкого натра до появления интенсивного синего окрашивания.

Определение азота аминокислот медным способом. Описано ниже, в работе «Гидролитическое расщепление белка ферментами поджелудочной железы» (см. с. 146).