ПЕРЕАМИНИРОВАНИЕ (ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ) АМИНОКИСЛОТ

Общие сведения.

Трансаминирование играет важную роль в процессах биологического распада и синтеза аминокислот. Реакция переаминирования, открытая советскими учеными А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман, заключается в переносе аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту, которая таким образом преобразуется в аминокислоту. Аминокислота — донатор аминогруппы, кетокислота — ее акцептор. Реакция катализируется

ферментами трансаминазами, простетической группой которых служит фосфопиридоксаль, являющийся промежуточным переносчиком аминогруппы. Присоединив аминогруппу, фосфопиридоксаль превращается в фосфопиридоксамин, с которого уже аминогруппу принимает кетокислота.

Принцип работы.

Аланин и а-кетоглютаровая кислота подвергаются переаминированию с образованием пировиноградной и глютаминовой кислот:

Образование пировиноградной кислоты можно доказать реакцией с салициловым альдегидом (оранжевая окраска). Для того чтобы задержать процесс на стадии образования пировиноградной кислоты и предотвратить ее восстановление в молочную, к реакционной смеси добавляют монобромуксусную кислоту.

Реактивы: а) L-аланин, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия; б) а-кетоглютаровая кислота, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия. Раствор предварительно нейтрализуют 2%-ным раствором двууглекислого натрия или 0,2 М раствором едкого натра, добавляя рассчитанное его количество; в) двууглекислый натрий (бикарбонат натрия), 0,1 М раствор; г) монобромуксусная кислота М раствор, нейтрализованный щелочью; д) трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; е) салициловый альдегид, 2%-ный спиртовой раствор; ж) кали едкое, концентрированный раствор (100 г КОН растворяют в 60 мл дистиллированной воды).

Животное (мышь, крысу, кролика) быстро обезглавливают. На холоду быстро готовят кашицу из скелетных

мышц. Из мышечной кашицы берут навески по 1 г (на маленьких часовых стеклах или кусочках плотной бумаги), которые до начала опыта хранят в холодильнике.

Опыт проводят в трех больших пробирках: первая и вторая — контрольные, третья — опытная. В первую пробирку вносят по 2 мл растворов аланина и двууглекислого натрия и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты; во вторую — то же, но вместо аланина приливают 2 мл раствора а-кетоглютаровой кислоты; в третью — по 2 мл растворов аланина и а-кетоглютаровой кислоты и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты. Затем быстро во все три пробирки одновременно вносят мышечную кашицу, перемешивают, пробирки закрывают пробками и помещают в термостат при 37—38° на 1 ч, все время встряхивая пробы (удобно пользоваться ультратермостатом или, еще лучше, аппаратом для встряхивания пробирок с термостатной ванной).

Через час пробы вынимают, в пробирки для осаждения белков приливают по 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают для перемешивания и через 3— 5 мин. фильтруют.

К 2 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 2 мл раствора едкого кали и 1 мл раствора салицилового альдегида, пробирки встряхивают и ставят на 10— 12 мин. в водяную баню или ультратермостат при температуре 37—38°.

Жидкость в опытной пробирке принимает интенсивное оранжевое окрашивание, свидетельствующее о наличии пировиноградной кислоты, в контрольных пробирках окраска жидкости остается светло-желтой.