ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ (ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ)

Общие сведения.

К классу оксидоредуктаз относятся многочисленные ферменты, катализирующие реакции биологического окисления. Это — сложные белки (протеиды), в состав простетических групп которых входят витамины группы В (рибофлавин, амид никотиновой кислоты и др.), металлы (железо, медь), нуклеотиды.

Роль коферментов в процессах биологического окисления заключается главным образом в переносе электронов от вещества, подвергающегося окислению (донора электронов), к восстанавливаемому соединению (акцептору электронов). Совокупность промежуточных переносчиков электронов образует окислительно-восстановительную (или дыхательную) цепь, особенностью которой является то, что каждый из коферментов попеременно выступает то как акцептор электронов (по отношению к субстрату — донору), то как донор (по отношению к последующему веществу или кислороду, которые служат акцепторами).

К числу важнейших коферментов процессов биологического окисления следует отнести кодегидрогеназы I и II (активной группой которых является амид никотиновой кислоты), а также флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид (производные витамина — рибофлавина).

Кодегидрогеназа I (никотинамидадениндинуклеотид, НАД) находится в тканях преимущественно в окисленной форме. Является акцептором водорода, который отнимается от субстрата, подвергающегося окислению.

Кодегидрогеназа II (никотинамидадениндинуклеотид-

— фосфат, НАДФ) отличается от НАД наличием еще одного остатка фосфорной кислоты, присоединенного к третьему углеродному атому рибозы аденнннуклео-тида.

В обратимых окислительно-восстановительных реакциях участвует не вся молекула кофермента, а лишь ее отдельные части. Так, у кодегидрогеназ (НАД и НАДФ) обратимому восстановлению — окислению подвергается амид никотиновой кислоты.

У флавиновых коферментов активной группой является изоаллоксазин

К классу оксидоредуктаз относятся также гемсодержащие ферменты, в состав коферментов которых входит железопорфириновый комплекс — гем (каталаза, пероксидаза).

Качественные реакции на ферменты биологического окисления.

Открытие в картофеле. О-дифенолоксидаза (полифенолоксида-за, тирозиназа) содержит медь. Катализируют реакцию окисления ортодифенолов и монофенолов (в том числе и аминокислоты тирозина) молекулярным кислородом с образованием хинонов. Реакция протекает по схеме

Реактивы: а) экстракт из клубней картофеля: навеску мякоти клубней (3—5 г) быстро растирают с несколькими миллилитрами дистиллированной воды; б) гваяковая смола, -ный спиртовой раствор.

В пробирку наливают 10—12 капель экстракта из клубней картофеля, добавляют 5—8 капель спиртового

раствора гваяковой смолы и наблюдают изменение окраски. Повторяют реакцию, беря воду вместо экстракта из картофеля.

Реакции на пероксидазу. Пероксидаза широко распространена в тканях животных и растений. По химической природе является гемопротеидом: в состав ее простетической группы входит железопорфирин.

Фермент катализирует реакцию окисления некоторых органических соединений (фенолов, полифенолов, ароматических аминов) в присутствии перекиси водорода, с которой пероксидаза образует комплексное соединение. Активированная перекись становится акцептором водорода, отщепляемого от соединения, которое подвергается окислению (донора).

Общая схема реакции такова:

В лаборатории в качестве источников пероксидазы обычно используют корни хрена, листья капусты, свежий мясной фарш, корнеплоды брюквы, репы.

Реакция с гваяковой смолой. Гваяковая смоляная кислота окисляется перекисью водорода (при участии пероксидазы) в озонид — соединение синего цвета.

Реактивы: а) экстракт из корней хрена: 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05%-ного раствора углекислого натрия и настаивают 2-3 ч, после чего фильтруют. Готовят в день анализа; б) гваяковая смола, 1%-ный спиртовой раствор, или -ный раствор гваякола; в) перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.

К 2-3 мл раствора перекиси водорода добавляют 5—8 капель спиртового раствора гваяковой смолы, 10 капель экстракта из хрена и встряхивают пробирку. Появляется синее окрашивание, обусловленное окислением

гваяковой смолы. Повторяют ту же реакцию с прокипяченным экстрактом из хрена — синее окрашивание не появляется, фермент инактивирован.

Пурпурогаллиновая реакция. При участии пероксидазы пирогаллол окисляется перекисью водорода до пурпурогаллина (красный осадок)

Реактивы: а) экстракт из корней хрена (см. выше); б) пирогаллол, 2%-ный водный раствор; б) перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.

В две пробирки наливают по 2 мл экстракта из корней хрена. Одну из них нагревают до кипения и охлаждают. В обе пробирки добавляют по 1 мл раствора пирогаллола и 1—2 капли раствора перекиси водорода.

Осадок пурпурогаллина выпадает только в той пробирке, в которой фермент не был инактивирован кипячением.

Реакция с бензидином. Пероксидаза катализирует реакцию окисления бензидина в дифенохинондиимин.

Белок мышечной ткани миоглобин обладает перокси-дазной активностью. Для свежего мяса характерна положительная реакция на пероксидазу, в несвежем мясе она не проявляется или запаздывает.

Реактивы: а) вытяжка из мяса: 10 г фарша свежего мяса заливают 40 мл дистиллированной воды, настаивают 10 мин. и фильтруют: б) бензидин, 0,25%-ный спиртовой раствор; в) перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.

К 2-3 мл вытяжки из мяса добавляют 3—5 капель спиртового раствора бензидина и 2—3 капли раствора перекиси водорода. Если мясо свежее, содержимое пробирки

почти тотчас же принимает зеленовато-синее окрашивание.

Определение активности пероксндазы в мышцах или крови. В основу метода положена описанная выше реакция окисления бензидина в дифенохинондиимин, катализируемая пероксидазой:

Молекула дифенохинондиимина конденсируется с молекулой бензидина с образованием окрашенного соединения (бензидинового синего)

Реактивы: а) свежая кровь кролика, разведенная 1:1000, или вытяжка из мышечной ткани: 1 г измельченной свежей мышечной ткани заливают 4-5 мл дистиллированной воды и экстрагируют в течение 30 мин., после чего фильтруют; б) бензидин, 1%-ный раствор в ледяной уксусной кислоте; в) перекись водорода, раствор, свежеприготовленный; г) едкий натр, 30%-ный раствор; д) этиловый спирт, абсолютный; е) марганцовокислый калий, 0,01 н раствор; ж) стандартный раствор: в мерную колбу емкостью 25 мл вносят 2 мл 1 %-ного раствора

бензидина (пипеткой с резиновой грушей!), добавляют 3 мг 0,01 и раствора марганцовокислого калия и оставляют на 10 мин., чтобы жидкость приобрела интенсивнокрасное окрашивание, затем прибавляют 10 мл 30%-ного раствора едкого натра и доливают до метки абсолютным спиртом. Готовят перед самым определением.

В мерную колбу на 25 мл вносят 2 мл раствора бензидина, 2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и 1 мл вытяжки из мышечной ткани или разведенной крови (1:1000). Колбу встряхивают и ставят точно на 3 мин., после чего в нее приливают -ного раствора едкого натра и снова встряхивают. Выпадает окрашенный осадок, который растворяют в абсолютном спирте. Им же доводят содержимое колбы до метки.

Интенсивность окраски испытуемого и стандартного растворов сравнивают в колориметре.

За единицу активности фермента принята активность пероксидазы, при которой в данной реакционной смеси развивается окрашивание, равное по интенсивности окраске стандартного раствора.

Активность фермента (в условных единицах на 1 г ткани) рассчитывают по формуле

где - высота столба стандартного раствора, мм; высота столба испытуемого раствора, мм; 25 — объем раствора в мерной колбе, — суммарный объем реагирующих растворов (бензидина, перекиси водорода и вытяжки из мышечной ткани) в колбе,

Определение активности пероксидазы в растительном материале (по А. Н. Бояркину). Определяют скорость катализируемой пероксидазой реакции окисления бензидина в дифенохинондиимин с образованием синеокрашенного продукта конденсации последнего с молекулой бензидина (бензидинового синего). Химизм реакции — см. с. 126.

Реактивы и приборы: а) ацетатная буферная смесь pH 4,7 (см. прил. 12); б) раствор бензидина на ацетатном буфере pH 4,7: в мерную колбу емкостью 200 мл наливают 60-80 мл дистиллированной воды, приливают 2,3 мл ледяной уксусной кислоты, после чего всыпают 0,184 г бензидина. Колбу ставят на водяную

баню (60°) и, взбалтывая, подогревают до полного растворения бензидина, затем прибавляют 5,45 г уксуснокислого натрия, взбалтывают до его растворения. Колбу охлаждают до 20° С и доводят до метки дистиллированной водой; в) перекись водорода, 3%-ная; г) фотоэлектроколориметр ФЭК-М, ФЭК-Н-57 или ФЭК-60; д) секундомер; е) центрифуга.

Из средней пробы растительного материала берут навеску г (в зависимости от предполагаемой активности фермента), тщательно растирают ее в ступке с ацетатным буфером. Растертую массу переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки, после чего центрифугируют при 4000—5000 об/мин (или фильтруют). В две кварцевые кюветы фотоэлектроколориметра (толщина слоя 2 см) вносят по 2 мл центрифугата (или фильтрата), 2 мл раствора бензидина и 2 мл дистиллированной воды. Измерения ведут при красном светофильтре ( нм). Устанавливают нулевую точку прибора, затем с помощью правого барабана отводят стрелку гальванометра в крайнее правое положение . В левую кювету быстро добавляют 2 мл воды, а в правую — 2 мл перекиси водорода (с помощью пипетки с широким отверстием). Вливая первую каплю перекиси, включают секундомер, поскольку начинается реакция окисления бензидина, катализируемая пероксидазой. Стрелка гальванометра двигается к нулевому делению шкалы. Как только она достигнет нулевого деления, отсчет времени прекращают. Подбирают такую навеску материала и разведение вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за 30—50 с, для чего вытяжку после центрифугирования дополнительно разводят ацетатной буферной смесью.

Активность фермента (А) рассчитывают по формуле

где Е — экстинкция, равная 0,125; а — отношение количества буферной смеси, взятой для экстрагирования фермента к навеске растительной ткани (г); б — степень дополнительного разведения вытяжки после центрифугирования; в — степень постоянного разведения вытяжки в кювете; с — толщина слоя в кювете фотоэлектроколориметра (2 см); t — время, с.

Определение активности полифенолок-сидазы (о-дифенолоксидазы, тирозиназы, катехолоксидазы) (по А. Н. Бояркину). Фенольные соединения — важные компоненты окислительновосстановительных процессов. Окисляясь кислородом воздуха, они превращаются в хиноны. Реакция катализируется ферментом полифенолоксидазой (о-дифенолок-сидазой, тирозиназой, катехолоксидазой). Схематически эта реакция может быть представлена так:

Хиноны подвергаются восстановлению водородом дыхательного субстрата до фенолов, которые снова включаются в реакцию окисления, протекающую при участии фермента.

Полифенолоксидаза действует на полифенолы, о-ди-фенолы, монофенолы, дубильные вещества. Фермент катализирует также окисление аминокислоты тирозина с образованием темноокрашенных продуктов меланинов.

Система «полифенолхинон» играет видную роль в дыхании растений, являясь промежуточным звеном при окислении многочисленных органических соединений (в том числе аскорбиновой кислоты).

При количественном определении активности поли-фенолоксидазы измеряют скорость реакции окисления диметилпарафенилендиамина с образованием продукта, окрашенного в сине-фиолетовый цвет.

Реактивы и приборы: а) диметил-парафенилендиамин, 0,02%-ный раствор на 0,01 н растворе щавелевой кислоты; б) щавелевая кислота, 0,01 н раствор; в) пирокатехин, 1%-ный раствор на 0,01 н растворе щавелевой кислоты; г) фосфатная буферная смесь, pH 7,4 (см. прил. 12); д) фотоэлектроколориметр, ФЭК-М или ФЭК-Н-57; е) секундомер; ж) центрифуга.

Навеску растительной ткани берут на аналитических весах. Ее тщательно растирают в ступе с фосфатной буферной смесью, затем количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят буфером до метки. Взвесь центрифугируют (4000 об/мин) или фильтруют.

В две кварцевые кюветы фотоэлектроколориметра (толщина слоя 2 см) вносят по 2 мл центрифугата (или фильтрата), 2 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора диметил-парафенилендиамина. Нулевую точку прибора

устанавливают при красном или оранжевом светофильтре нм), после чего правым барабаном отводят стрелку гальванометра в крайнее правое положение В контрольную левую кювету прибавляют 2 мл раствора щавелевой кислоты, а в опытную (правую) кювету раствора пирокатехина и тотчас же включают секундомер. В остальном поступают, как при определении пероксидазы.

Активность полифенолоксидазы выражают в условных единицах на 1 г растительного материала. Вычисление ведут по формуле, приведенной в работе «Определение активности пероксидазы в растительном материале».

Спектрофотометрическое определение активности аскорбпнатоксидазы (по Арригони, в прописи Н. П. Ярош, А. И. Ермакова и В. В. Арасимович). Аскорбинатоксидаза (аскорбиноксидаза) катализирует реакцию окисления аскорбиновой кислоты кислородом воздуха (химизм реакции см. с. 83). Фермент аскорбинатоксидаза широко распространен в растительном мире. Высокой активностью фермента характеризуются капуста, огурцы, тыква, кабачки. Активность аскорбинатоксидазы обычно определяют по количеству аскорбиновой кислоты, превращенной в дегидроформу 1 г ткани за единицу времени.

Аскорбиновая кислота обладает максимумом поглощения света при длине волны нм. Под действием фермента она окисляется. Степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна активности фермента, ее можно определить по уменьшению оптической плотности раствора.

Реактивы и приборы: а) фосфатная буферная смесь, (см. прил. 12); б) хлористый калий М раствор; в) сернокислый магний М раствор; г) аскорбиновая кислота, 0,005 М раствор; д) спектрофотометр

Навеску растительной ткани (1 г) берут на аналитических весах. Ее тщательно растирают в ступке с фосфатной буферной смесью, после чего количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят буфером до метки. Затем центрифугируют или фильтруют.

В одну из кювет спектрофотометра (опытную) вносят 0,1 мл ферментной вытяжки (центрифугата или

фильтрата), 0,1 мл раствора хлористого калия, 0,1 мл раствора сернокислого магния, 0,7 мл раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл фосфатной буферной смеси, во вторую (контрольную) -2,3 мл буферной смеси и 0,7 мл раствора аскорбиновой кислоты. Сразу же после внесения растворов измеряют оптическую плотность опытной кюветы, потом измерения повторяют через 1, 2, 3, 4, 5 мин. Активность аскорбинатоксндазы определяют в единицах оптической плотности на 1 г ткани за 1 мин.