КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ С ПОМОЩЬЮ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ (по О. А. Павлиновой)

Количественное определение сахаров с применением хроматографии на бумаге включает в себя следующие основные операции: а) фиксацию растительного материала; б) экстракцию сахаров и очистку вытяжки от белков и других примесей; в) распределительную хроматографию сахаров на бумаге; г) элюцию сахаров с бумаги; д) определение их содержания в элюатах.

Реактивы и материалы: а) хроматографическая бумага Ленинградская «быстрая» № 1; «Filtrak» FN-4; ватман № 1 и 2; б) этанол, 96%-ный и 80%-ный; в) уксуснокислый свинец (средний)

раствор; г) сернокислый натрий, насыщенный раствор; д) смесь-н-бутанола, пиридина и воды в соотношении 6:4:3 (по объему), или е) смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (по объему). Если смеси растворителей разделяются на два слоя, то берут верхний; ж) проявители на кетозы: I — резорцинфосфат. 0,2 г резорцина растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Перед проявлением хроматограммы смешивают 10 объемов спиртового раствора резорцина С ОДНИМ объемом ортофосфорной КИСЛОТЫ мочевина. 5 г мочевины растворяют в спирта и добавляют 20 мл

2 н раствора соляной кислоты; з) проявители на альдозы: I — анилинфталат (см. с. 212); II-анилиноксалат: 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 50 мл 96%-ного этанола, после чего смешивают с равным объемом 0,2 М раствора щавелевой кислоты в этаноле (можно также брать водный 0,2 М раствор щавелевой кислоты); и) глюкоза, фруктоза, сахароза и другие сахара, -ные растворы; к) реактивы для количественного определения сахаров по антроновому методу (см. с. 225).

Навеску свежего растительного материала (10—30 г) заливают (для фиксации) десятикратным объемом кипящего 96%-ного этанола, нагревают 2—3 мин., добавляя небольшое количество углекислого кальция или натрия в порошке для нейтрализации кислот (под контролем лакмуса или универсального индикатора). Зафиксированная навеска (в колбе или склянке с притертой пробкой) может храниться в течение нескольких месяцев (в темном и прохладном месте). Фиксация спиртом является и началом экстракции сахаров, которые частично переходят в раствор.

Сахара экстрагируют горячим (70—80°) 80%-ным этанолом 3 раза по 30 мин. Перед началом экстракции рекомендуется дополнительно растереть материал в ступке. Спирт, который служил для фиксации навески, объединяют со спиртовыми вытяжками.

После каждой экстракции охлажденную спиртовую вытяжку центрифугируют. Объединенные спиртовые вытяжки сгущают в вакууме до небольшого объема (2—3 мл). Если материал богат хлорофиллом и каротиноидами, то сгущенную вытяжку несколько раз взбалтывают с петролейным эфиром. Эфирный раствор пигментов

сливают, а остатки растворителя удаляют на водяной бане при 50—60°.

Сгущенную вытяжку количественно переводят в мерную колбу на 5 или 10 мл. Для осаждения белков и других примесей прибавляют по каплям раствор уксуснокислого свинца. Проверив полноту осаждения, раствор в колбе доводят до метки, затем фильтруют или, еще лучше, центрифугируют. Для осаждения избытки свинца, не вошедшего в реакцию, добавляют одну каплю насыщенного раствора сернокислого натрия и снова центрифугируют или фильтруют.

Рис. 16. Схема разделения сахаров на хроматограмме и определение положения пятен на основной, непроявленной части (по О. А. Павлиновой): а и б — опрыскивание резорцинфосфатом. а — опрыскивание анилинфталатом; в непроявленная основная часть хроматограммы. С — сахароза; Г — глюкоза; Ф — фруктоза; 3 —олигосахариды.

Нарезают полосы хроматографической бумаги длиной 50—55 см и шириной 13—19 см или другого размера (в зависимости от диаметра хроматографической камеры). Бумагу разлиновывают графитовым карандашом, оставляя с одной стороны листа одну, а с другой — две контрольные полосы шириной 2— 2,5 см (рис. 16).

Низ хроматограммы вырезают зубцами, что способствует равномерному скапыванию растворителя и предотвращает наблюдающийся иногда перекос пятен. Затем на линию старта отдельными пятнами по одному на основной части хроматограммы и на каждой из контрольных полос наносят с помощью микропипетки или капилляра определенный точный объем испытуемого раствора (например, по 0,01; 0,02 или 0,03 мл в пятно). Количество экстракта, наносимого в пятно, должно соответствовать примерно 30—50 мг сырого веса исследуемого материала в том случае, если в нем содержится 5—7 мг глюкозы, фруктозы и сахарозы на 1 г сырого веса ткани. Для установления оптимальной концентрации сахаров, вносимых в пятно, ставят отдельно две

контрольные хроматограммы с нанесением различных объемов опытного экстракта (0,01-0,04 мл в пятно). На те же полосы наносят также и метчики — растворы сахаров растворов).

После нанесения растворов на бумагу приступают к разделению сахаров в соответствующей смеси растворителей (н-бутанол — пиридин — вода, 6:4:3; н-бутанол — уксусная кислота — вода, 4:1:5). Хроматография нисходящая. Продолжительность разделения 2—3 суток.

После разделения хроматограммы высушивают в токе воздуха (в вытяжном шкафу) до полного удаления следов растворителя. Следующей задачей является определение положения пятен на основной части хроматограммы, так как сахара элюируют из непроявленной части бумаги. Для этого от основной хроматограммы отрезают контрольные полосы а, а и б и опрыскивают две из них, например а и б, проявителями на кетозы (резорцинфосфатом или раствором мочевины), а полосу а — проявителем на альдозы (анилинфталатом или анилиноксалатом).

Полосу, опрыснутую резорцинфосфатом, прогревают 3—4 мин. в сушильном шкафу при температуре 85—95°. Пятна фруктозы, сахарозы, раффинозы и олигосахаридов, содержащих фруктозу, окрашиваются в интенсивно розовый цвет.

При нагревании хроматограммы, опрыснутой раствором мочевины, в течение 5 мин. при 105° пятна кетоз принимают синее окрашивание.

Полосу, обработанную раствором анилинфталата или анилиноксалата, нагревают при 105—110°. При обработке хроматограммы анилинфталатом глюкоза и галактоза проявляются в течение 5 мин. при 105° в виде желтовато-коричневых пятен; пятна пентоз вишнево-красного цвета. Мальтоза и лактоза дают желто-коричневые пятна при нагревании в течение 20 мин. при 105°. При проявлении анилиноксалатом (110°, 5—6 мин.) пятна альдоз имеют коричневое окрашивание.

Проявленные контрольные полосы с, а и б прикладывают к основной части хроматограммы (в и таким образом определяют положение пятен отдельных сахаров на полосе в, не проявляя ее. Участки бумаги, содержащие непроявленные пятна глюкозы, фруктозы, сахарозы

и олигосахаридов, вырезают, разрезают на маленькие кусочки («лапшу») и элюируют сахара водой три раза по 30 мин. при 60—70°. Элюаты фильтруют через маленькие бумажные фильтры, выпаривают на водяной бане до небольшого объема, снова фильтруют и доводят до определенного объема.

В растворе определяют содержание сахара с помощью антронового реактива.