КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК (по Дише)

При нагревании дезоксирибозы с раствором дифениламина в смеси ледяной уксусной и серной кислот развивается синее окрашивание, имеющее максимум поглощения при 595 нм.

Механизм реакции заключается в образовании оксилевулинового альдегида и конденсации последнего с дифениламином с образованием окрашенного соединения.

Реактивы: а) раствор или суспензия ДНК, (приготовление — см. предыдущую работу); б) реактив Дише: 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.

Примечание. Для приготовления реактива Дише рекомендуется брать дифениламин, дважды перекристаллизованный из 70%-иого этилового спирта.

К 1-2 мл раствора (или суспензии) ДНК приливают двойной объем реактива Дише, нагревают 10 мин. на кипящей водяной бане, затем охлаждают. Жидкость окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет. Измеряют поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным (лучше оранжевым) светофильтром (595 нм) против контроля (реактив Дише).

Содержание ДНК в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартному раствору натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с известным содержанием фосфора (9,89-10,0%, в пересчете на чистую ДНК).