ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ, НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ

Общие сведения. В биологическом материале свободные пуриновые и пиримидиновые основания встречаются в небольших количествах. Они, как известно, являются компонентами дезоксирибонуклеиновых и нуклеиновых кислот и освобождаются при их гидролитическом расщеплении. Подвергая гидролизу ДНК действием концентрированных растворов минеральных кислот (например, 6 н соляной кислоты или 12 н хлорной) при 100° С, можно добиться почти количественного освобождения пуриновых

и пиримидиновых оснований. Для высвобождения нуклеозидов и нуклеотидов следует применять более мягкий метод — энзиматический.

Значительно легче гидролизуются рибонуклеиновые кислоты. Уже раствор серной или соляной кислот расщепляют РНК до пуриновых оснований и пиримидиновых нуклеотидов. Этот способ гидролиза позволяет установить неодинаковую прочность гликозидных связей в пуриновых и пиримидиновых нуклеотидах, так как последние в описанных условиях почти не подвергаются дальнейшему расщеплению. Пиримидиновые основания освобождаются лишь при гидролизе РНК 12 н раствором хлорной кислоты (1ч при 100°С).

Для того чтобы выделить свободные мононуклеотиды, проводят гидролитическое расщепление РНК 0,3 н раствором едкого натра в течение 18 ч при температуре 37° С.

Стандартные растворы. Готовят раствор свободных пуриновых и пиримидиновых оснований ) в 10%-ном растворе изопропанола, к которому добавляют 10% уксусной кислоты.

Гуанин растворяют (в количестве 1 мг/мл) в 0,1 н растворе соляной кислоты.

Нуклеозиды и нуклеотиды (в концентрации 4 мг/мл) растворяют в -ном растворе изопропанола. Их стандартные растворы сохраняют в морозильной камере холодильника при температуре .

На хроматограммы наносят по растворов.

Системы растворителей.

Употребляют следующие системы растворителей.

I. Смесь бутанола, уксусной кислоты и воды

5). Применяют для разделения смеси оснований, а также пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеотидов.

II. Смесь изопропанола, концентрированной соляной кислоты и воды Используют для разделения свободных пуриновых и пиримидиновых оснований. В этой смеси разделение происходит медленно. Хроматограммы высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для того чтобы удалить следы соляной кислоты, высушенную хроматограмму выдерживают несколько минут над кипящей водяной баней, а затем снова сушат на воздухе.

В табл. 3 представлены данные, характеризующие

Табл. 3. Значение пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов (бумага ватман № 1)

значения пуриновых и пиримидиновых оснований, а также нуклеозидов и нуклеотидов в описанных системах растворителей.

Проявители. Проявители реагируют с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, пентозами и остатками фосфорной кислоты.

Ультрафиолетовые лучи. Пуриновые и пиримидиновые основания, а также нуклеозиды и нуклеотиды, в состав которых они входят, поглощают ультрафиолетовые лучи в границах 250—280 нм. При просмотре хроматограмм в ультрафиолетовых лучах они становятся заметными в виде темных пятен на светло-голубом флуоресцирующем фоне бумаги. Границы пятен очерчивают графитовым карандашом.

Азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий. Является реактивом на пуриновые основания. В состав проявителя входят: а) азотнокислое серебро, 2%-ный раствор; б) двухромовокислый натрий (бихромат натрия), 0,5%;-ный раствор; в) азотная кислота, 0,5 н раствор.

Хроматограмму опрыскивают раствором азотнокислого серебра, после чего погружают в раствор бихромата натрия. Выпадает красный осадок хромата серебра. Затем хроматограмму переносят в раствор азотной кислоты, в котором происходит медленное растворение осадка. Красная окраска остается лишь в местах комплекса хромата серебра с аденином и гуанином. Если при этом фон хроматограммы сохраняет еще розовую окраску, бумагу следует перенести в сосуд с водой и несколько раз прополоскать.

Ртутный проявитель. С его помощью можно открыть пиримидиновые основания — урацил, цитозин, тимин.

Хроматограмму погружают на 30 секунд в раствор, состоящий из 1 части 0,1 М раствора уксуснокислой ртути, 3 частей 1 М раствора уксуснокислого натрия и 6 частей воды. Затем хроматограмму перекладывают на 20 секунд в кювету с проточной водой, после чего сразу же погружают в -ный раствор сернокислого аммония до появления черных пятен.

Проявитель на фосфорную кислоту. Состоит из четырех компонентов: а) раствор молибденовокислого аммония (1 г соли в 8 мл воды); б) соляная кислота, концентрированная; в) хлорная кислота, раствор; г) ацетон. Перечисленные компоненты смешивают в отношении (перед употреблением). Указанной смесью опрыскивают хроматограмму, которую затем высушивают при комнатной температуре и освещают ультрафиолетовыми лучами (кварцевой лампой) в течение 30 мин. Соединения, в состав которых входят фосфатные группы, дают голубые пятна. Голубой оттенок фона можно снять парами аммиака.

Хроматографическая идентификация продуктов гидролиза ДНК.

Реактивы и материалы: а) препарат соляная кислота, 6 н раствор, в) соляная кислота, 0,1 н раствор, г) хроматографическая бумага ватман № 1 или стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований (см. с. 62); е) системы растворителей I и II (см. с. 62); ж) проявитель азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий; з) ртутный проявитель.

Г идролиз. 5—20 мг препарата ДНК вносят в пробирку, туда же прибавляют н раствора соляной

кислоты. Пробирку запаивают и помещают в сушильный шкаф при 100° С на 3 ч. Полученный гидролизат досуха испаряют в вакуумном эксикаторе (над твердым КОН). Остаток растворяют в таком количестве 0,1 н раствора соляной кислоты, чтобы получить раствор (учитывая количество ДНК, взятой для гидролиза).

Хроматография. Берут четыре листа хроматографической бумаги размерами 12X40 см. На середину линии старта наносят по 5 мкл исследуемого гидролизата, а по сторонам — стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований. Раствор гуанина наносят только на лист № 4.

Хроматограммы № 1 и 2 ставят в сосуды с системой растворителей I, а № 3 и 4 — в сосуды с системой II. Хроматографию продолжают до тех пор, пока фронт растворителя не поднимется хотя бы на 20 см (в системе I это продолжается около 3 ч, в системе II — 22-24 ч).

Хроматограммы высушивают (см. выше) и просматривают в ультрафиолетовых лучах. Пятна азотистых оснований очерчивают графитовым карандашом, после чего хроматограммы № 1 и 2 обрабатывают ртутным проявителем, а листы № 3 и 4 — проявителем азотнокислое серебро —двухромовокислый натрий. Определяют соединений и с помощью табл. 3 производят их идентификацию.

Хроматографическая идентификация продуктов гидролиза РНК.

Реактивы и материалы: а) препарат РНК; б) соляная кислота, 1 н раствор; в)хроматографическая бумага ватман № 1 или стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований; д) система растворителей II (см. с. 62); е) проявитель азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий;

ж) проявитель на фосфорную кислоту (см. с. 64);

з) проявитель на а-диоловую группу: 1) иоднокислый калий (перйодат калия, ), насыщенный раствор (около бензидин, 0,1 М раствор в 50%-ном метаноле. Раствор бензидина смешивают с ацетоном и 0,2 н раствором соляной кислоты в отношении 3) бензидин, 0,1 М раствор в 50%,-ном метаноле, смешанный с 0,8 н раствором соляной кислоты в отношении 1: 1.

Хроматограмму опрыскивают раствором 1, а через раствором 2. Соединения, имеющие а-диоловую группу, дают белые пятна на голубом фоне.

С помощью этого же проявителя можно отличить кетозы и аминосахара от других соединений с а-диоловой группой. Для этого проявленную хроматограмму дополнительно опрыскивают раствором 3 и прогревают 1 мин. при 110°. Пятна кетоз и аминосахаров остаются белыми, тогда как остальных соединений принимают голубое окрашивание.

Гидролиз. 10 мг исследуемого препарата РНК вносят в пробирку с 1 мл 1 н раствора соляной кислоты. Пробирку запаивают и выдерживают 1 ч в сушильном шкафу при 100° С. Гидролизат охлаждают.

Хроматография. На листе хроматографической бумаги линию старта делят на три отрезка по 8 см. В каждом из них отмечают три точки. Отрезок А предназначен для идентификации пуриновых оснований гидролизата, В и С — для пиримидиновых оснований.

В среднюю точку каждого отрезка наносят по 5 мкл гидролизата, а в крайние — соответствующие стандартные растворы. Хроматографию проводят в системе II в течение 22-24 ч. За это время растворитель должен подняться по бумаге не менее чем на 20 см.

Хроматограмму высушивают на воздухе, просматривают в ультрафиолетовых лучах, пятна очерчивают графитовым карандашом, после чего бумагу разрезают на полоски, соответствующие отрезкам А, В и С. Отрезок А проявляют проявителем азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий, В — проявителем на фосфорную кислоту, а отрезок С — проявителем на а-диолы.